中华鳖“腐皮、疖疮”并发症致病菌的病原分离与药敏试验分析

2013-11-21罗方兴肖宗琳谢伟伟肖克宇

湖南师范大学自然科学学报 2013年4期

曾丹,钟蕾,罗方兴,肖宗琳,谢伟伟,肖克宇 1

(湖南农业大学动物科学技术学院, 中国长沙 410128)

中华鳖(Trionyxsinensis)，俗称鳖、甲鱼、王八、脚鱼、水鱼等[1]．是一种名贵的水生经济动物，其食用与药用价值较高，在医学上具有滋阴壮阳、利肝益肾、清热消淤、破结软坚等功能[2]．中华鳖在我国广泛分布，除新疆、西藏和青海外，其他各省均产．国外分布于越南、日本、帝汶岛及夏威夷群岛等地[3]．中华鳖的人工温室养殖由于集约化程度高，养殖密度大，很容易滋生病菌，引起疾病发生[4]．谭北平[5]、姚金水[6]、李占魁[7]等研究了中华鳖腐皮病的病理组织、病原及防治方法．张开字[8]、雷道启[9]、陈含华[10]等研究中华鳖疖疮病得出控制温度、养殖密度、水质等因素是预防此病的有效措施．以上研究表明，中华鳖腐皮病的主要症状是颈部、尾部、背甲边缘等处皮肤发生糜烂、坏死；中华鳖疖疮病的主要症状是患病初期病鳖四肢基部、裙边、腹甲、背甲以及脖颈长出白色小粒疖疮，病情加重后疖疮向外凸起，继而溃烂成凹陷，炎症进一步扩散，严重时出现孔洞状，可以见到内脏．

本研究从湖南湘阴县某养殖场采回的中华鳖病样中，发现其均具有明显的腐皮和疖疮病症状，尽管目前对中华鳖疖疮病、腐皮病的病因、发病规律和防治技术等方面的研究报道较多，但依地域和养殖环境的不同，其病原亦有差别，且有关中华鳖疖疮、腐皮并发症的病原分离与鉴定的报道少见．本实验对导致中华鳖疖疮病、腐皮病并发症的致病菌进行了病原分离、生化鉴定和药敏试验，检测出致病菌的耐药性，为有效防治中华鳖腐皮、疖疮并发症提供一定的理论依据．

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 材料取湖南省湘阴县某中华鳖养殖场吊养的已呈明显发病状况且频死的20个中华鳖，体重在0.1～1 kg之间．头尾长0.18±0.02 m，宽0.09±0.01 m．确定患病中华鳖的标准：缩头缓慢、背腹部斑块、糜烂或孔洞等症状明显．

1.1.2 培养基营养琼脂培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，琼脂 15 g，H2O 1 L，pH 7.0．

1.2 方法

1.2.1 症状观察与组织涂片对采集的中华鳖病样进行肉眼观察并解剖，记录其主要症状．组织涂片后采用美兰染色，显微镜油镜观察和显微摄像．

1.2.2 病原菌分离用接种环在病鳖腹部、背部和内脏等病灶部位挑取组织液或内脏匀浆液，分别在普通营养琼脂平板上划线接种, 于28 ℃恒温培养24 h, 选取单个菌落接种于斜面, 再进行平板划线, 将分离到的细菌进行纯培养，保存至斜面备用．

1.2.3 分离菌的菌落形态观察及染色对培养出的细菌菌落进行观察,并对其大小、形态、颜色、隆起度等特征进行记录．对分离纯化的上述培养菌进行革兰氏染色,显微镜观察细菌的个体形态及染色特征．

1.2.4 分离菌的生理生化特性检查及菌种鉴定采用API-20E鉴定系统和菌种鉴定管对纯化菌株进行生理生化指标的测试(湖南天地人生物有限公司完成)，并人工补充其他的生理生化实验．细菌的生理生化试验按《常见细菌系统鉴定手册》[11]和《伯杰氏细菌鉴定手册》[12]方法进行．

1.2.5 人工感染试验将16 h的细菌培养物用质量分数为0.70%的无菌盐水制成菌悬液，选取0.4 kg左右健康的中华鳖各10尾，分别进行腹腔注射感染和创伤浸泡感染,每尾腹腔注射剂量为0.5 mL, 菌液浓度稀释为1.0×109个/mL, 同时以注射等量无菌生理盐水的健康中华鳖作为对照；创伤浸泡感染先用灭菌针头在中华鳖背腹部和腿部划痕, 再将其放置在含有2.0×109个/mL病原菌的水体中浸泡24 h, 然后在装有清水的水族箱中进行饲养观察，同时对照组用清水浸泡．水温控制在25～28 ℃，连续14 d观察并记录试验中华鳖的病症及死亡数目, 计算其死亡率．同时对人工感染发病濒死的中华鳖进行病原菌再分离, 检查所分离的菌株与原分离菌株在形态与理化特性等方面是否一致．

1.2.6 药物敏感试验将从患病中华鳖中分离出的菌株用无菌水调配成(1.0～1.5)×108个/mL的菌悬液(相当于0.5麦氏单位浓度)．取菌悬液 0.1 mL 放于无菌平皿中央，用涂布棒涂匀．在涂菌平板上均匀粘贴抗生素药敏纸片，每皿贴5～6片不同的药皿纸片，片间距离不少于 24 mm，纸片中心距平板边缘不少于 15 mm．将贴有药敏片的平板放于28 ℃的恒温生化培养箱里培养 24 h，取出后测量各个抑菌圈直径．根据抑菌圈直径大小结合《药敏试验纸片法的抑菌范围解释标准》判断细菌对药物的敏感性．药敏纸片购自杭州天和微生物试剂有限公司．由长沙天地人生物有限公司鉴定并提供结果．

2 结果

2.1 症状观察

观察自然发病和人工感染发病的中华鳖，发现其症状基本类似，主要为腿部和裙边出现明显红肿、糜烂，腹甲、背甲以及脖颈长出白色小粒疖疮，病情加重后疖疮向外凸起，继而溃烂成凹陷呈现孔洞状，解剖可见腹腔积水，内脏充血，肝脏明显肿大(如图1)．

2.2 美兰染色镜检结果

分别从患该病中华鳖的背甲、腹甲、肝脏、脾脏等处取样，用病变组织涂片进行美兰染色和光学显微镜镜检，发现有大量细菌存在(见图2)．

(a)背部溃疡和疖疮；(b)腹部白色突出物；(c)肝脏明显肿大；(d)腹腔积水 (a)背甲；(b)腹甲；(c)肝脏；(d)脾脏图1 发病中华鳖的体表和内脏病变(箭头所示) 图2 病变组织美兰染色镜检结果(10×40)Fig.1 The body surface and viscera lesions of infected trionyx sinensis Fig.2 Lesions methylene blue staining microscopic examination results

2.3 分离菌的菌落形态及染色结果

从患病中华鳖的内脏、四肢和背腹甲中共分离筛选得到2个优势菌株，分别标记为Z2012-1和Z2012-2．革兰氏染色显示两者均为革兰氏阴性短杆菌菌落形态(见表1)．

表1 Z2012-1和Z2012-2的菌落形态特征Tab.1 Colony shape features of Z2012-1 and Z2012-2

2.4 分离菌株的生理生化特性

根据细菌的形态特征，人工生化试验结果以及长沙天地人生物有限公司生化鉴定仪鉴定结果，将Z2012-1和Z2012-2菌株的生化特征汇总于表2，参照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰细菌鉴定手册》，确定Z2012-1和Z2012-2菌株分别为嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)和洛菲不动杆菌(Acinetobacterlwoffi)．

表2 生理生化反应Tab.2 Isolates physiological and biochemical reactions

2.5 人工感染试验结果

用两种菌1∶1混合感染健康中华鳖，经腹腔注射和浸泡感染进行试验，试验鳖均出现病症，其中腹部注射发病较快，第6天出现死亡，连续观察15天死亡率达100%；而浸泡感染发病较慢，中华鳖先是行动迟缓，体表出现小白点，然后停止进食，直至第10天陆续出现死亡，死亡率为60%(表3)．经解剖观察，患病中华鳖出现与正常养殖中发病中华鳖(图1)相似症状，病鳖体表多处溃疡和疖疮、肝脏肿大充血，并伴随大量腹水从体内流出．从人工感染濒死的中华鳖体内又分离到与原分离菌株形态特征及生理生化特性一致的细菌．

表3 健康中华鳖人工感染结果Tab.3 Results of artificial infection to healthy trionyx sinensis

2.6 药敏实验结果

从表4可以看出，嗜水气单胞菌对头孢噻肟、头孢曲松、头孢他啶、头孢呋辛、头孢吡肟、庆大霉素、阿米卡星、环丙沙星、左氟沙星、美洛培南、复方新诺明、氯霉素等药物高度敏感，对氨苄西林、头孢唑啉、头孢噻吩等药物中度敏感，对四环素、头孢西丁等药物具有耐药性．洛菲不动杆菌对头孢他啶、头孢曲松、左氟沙星、氧氟沙星、美洛培南、米诺环素、复方新诺明、氯霉素等药物高度敏感，对氨曲南、阿米卡星、妥布霉素、粘菌素等药物中度敏感，对哌拉西林、环丙沙星、庆大霉素等具有耐药性．

表4 药敏试验结果Tab.4 The results of sensitivity test of antibacterial drugs

3 讨论

目前国内外学者对引起中华鳖“腐皮、疖疮”并发症的主要致病菌的研究有一些，但尚未深入．近年来国内学者陆续报道不动杆菌可与嗜水气单胞菌等细菌混合感染水产动物，引起各种疾病．嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)属弧菌科,为革兰氏阴性短杆菌，对环境要求不高，广泛分布在江、河、湖中，是鱼类、两栖类、爬行类和哺乳动物的致病菌[13-14]．它能引发多种水生动物的传染病,有关嗜水气单胞菌致病性的研究，已有过大量的报道[15]．但有关洛菲不动杆菌在中华鳖细菌性疫病中出现的频率和致病机理尚未见报道．洛菲不动杆菌也称鲁氏不动杆菌，为条件致病菌，广泛分布于土壤、水体和污水中．一般认为不动杆菌的毒力很低，在机体抵抗力下降或免疫功能受损时易出现感染．在水产动物病害中, 洛菲不动杆菌可引起欧洲鳗鲡“红头病”[16]、胡子鲇“吊头病”[17]、金鱼“突眼病”[18]、鳜鱼的某种细菌病[19]、美国青蛙“抽搐症”[20]等．而本研究中由嗜水气单胞菌和洛菲不动杆菌感染引起中华鳖疖疮、腐皮并发症的报道，在国内尚属首次．

本实验从病鳖体平板划线法分离出致病菌，培养后进行形态学观察，对致病菌进行生理生化鉴定．再对致病菌进行药敏试验，检测出致病菌对不同药物的耐药性情况．试验表明，嗜水气单胞菌和洛菲不动杆菌这2种病原菌对头孢他啶、头孢曲松、头孢吡肟、左氟沙星、美洛培南、阿米卡星、米诺环素、复方新诺明、氯霉素等药物敏感，对四环素、哌拉西林、庆大霉素不敏感，这对以后中华鳖集约化养殖过程中疾病的预防与治疗提供理论基础．

参考文献：

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