灵芝总甾醇的闪式提取工艺优化及其抗氧化活性*
2013-11-21何荣军周菲赵月钧孙培龙
何荣军，周菲，赵月钧，孙培龙
(浙江工业大学生物与环境工程学院，浙江杭州，310014)
灵芝又叫灵芝草，属于担子菌纲，多孔菌目，多孔菌科，灵芝属，含有多种药理活性成分［1－4］。甾醇是其中比较重要的一类活性物质，目前已从灵芝中分离出20多种［5］。灵芝甾醇具有抗肿瘤作用［5］，对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤有保护作用［6］。灵芝甾醇的传统提取主要采用溶剂回流［7］和超声法［8］，前者提取1.5h、复提3次后得率为0.080 8%，后者得率为0.051%。与之相比，闪式提取法［9－10］通过负压、剪切、高速碰撞等各种外力作用使溶质迅速进入溶剂，能显著降低提取时间和温度，更适合甾醇的提取。本研究主要对灵芝甾醇的间歇式高速剪切闪式提取工艺进行优化，并对提取得到的总甾醇进行抗氧化活性研究。
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器
麦角甾醇标准品，上海源叶生物科技有限公司;灵芝，杭州市农业科学研究院;ABTS，DPPH为sigma产品，其余都为国产试剂。
GF-1型控时-调速式高速分散机，江苏海门麒麟医用仪器厂;6890N/5975C气相质谱联用仪，美国Agilent。
1.2 实验方法
1.2.1 灵芝总甾醇提取工艺
取5 g灵芝粉于250 mL烧杯中→加入一定体积95%乙醇，室温下剪切提取→抽滤得清液并浓缩至干→加入5 mL正己烷和5 mL水萃取→有机相浓缩至干→用10 mL无水乙醇溶解，测定总甾醇含量(以麦角甾醇计)。
1.2.2 灵芝甾醇提取条件优化
1.2.2.1 单因素实验
对乙醇浓度(体积分数分别为 100%，95%，85%，75%，65%)、剪切时间(2，4，6，8，10 min)、液料比［(20，25，30，35，40)∶1］(mL∶g)，提取温度(30，40，50，60，70 ℃)，转速(2 800，5 600，8 400，11 200，14 000 r/min)进行单因素实验。
1.2.2.2 响应面实验
选取3个因素，根据Box-Beknhen中心组合实验设计原理，设计实验，获取最佳提取工艺条件。
1.2.3 灵芝总甾醇组成及含量测定
1.2.3.1 GC-MS分析
参考何胜华［11］等对菜籽植物甾醇的GC-MS分析条件。
HP-5色谱柱(30 m ×0.25mm ×0.25 μm);载气为高纯度N2，体积流量1 mL/min;分流比20∶1;进样量1 μL;进样温度300℃;柱温285℃，温升5℃/min，320℃保持 30 min。电离方式 EI，电子能量70eV;离子源温度230℃;四级杆温度150℃。
样品前处理:取灵芝提取液浓缩至干，再用少量三氯甲烷溶解，用于GC-MS分析。
1.2.3.2 薄层色谱分析
在GF254硅胶板上点样，展开剂是V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=6∶1，在254 nm波长下观察。
1.2.4 灵芝总甾醇提取物的体外抗氧化活性实验
1.2.4.1 清除DPPH·的能力
调整MarijanaKosani c′［12］的DPPH反应体系，3.0 mL DPPH 溶液(1×10－4mol/L，无水乙醇配制)与200 μL样品液混合反应。
1.2.4.2 清除ABTS+·的能力
参照AnetaWojdy c′o［13］的ABTS法，加入样品改为10 μL，避光反应1h后测定734 nm处的吸光度。
1.2.4.3 清除羟自由基的能力
参照 Xiaoqin Huang［14］的方法作调整，所有试剂调整为0.5 mL并加入2 mL无水乙醇稀释，加入样品为 100 μL。
1.2.4.4 还原力测定
针对漏层承压堵漏制订现场方案：（1）下钻至堵漏目的层下部（推荐不携带钻头及止回阀等钻具）；（2）注、替堵漏浆过程中保持施工平稳，防止堵塞钻具水眼，使用20L·s-1排量注入配好的堵漏浆并提出钻具水眼。注意整个过程需专人观察返出情况，定时（不超过15min）记录一次泥浆量变化；（3）随后行关井、环空憋压挤注（挤注时套压不大于2MPa，多次憋注，检验地层承压能力的同时，也在逐渐提高地层承压能力）；（4）在泄压时，不宜一次性卸完压力，应分多次逐渐泄压，以防钻井液返吐造成井壁人为破坏；（5）泄压开井后静止等停6h后进行验堵，下钻时分段循环，缓慢、逐渐提高泵循环，循环2周再将排量提高至钻进时排量。
参照傅茂润［15］的方法，试剂调整为 2.0 mL，加入样品液 400 μL。
2 结果与分析
2.1 响应面试验结果与分析
2.1.1 响应面分析因素水平的选取
单因素实验结果表明，加大乙醇浓度和提取温度有助于提高总甾醇得率，但综合考虑成本及溶剂挥发等因素，最终选取95%乙醇和70℃。另选取转速、液料比、剪切时间3个因素，运用Box-Benhnken中心组合实验设计原理，进行响应面设计(RSA)，试验因素与水平设计见表1。
表1 响应面分析因素与水平Tab.1 Analytical factors and levels for RSA
2.1.2 响应面试验设计与结果
根据Design Expert软件的Box-Behnken试验设计原理，一共17个试验点，12个析因点，自变量取值在A、B、C所构成的三维顶点;5个零点，是区域的中心点，零点试验重复5次，用于估计试验误差。响应面试验方案及结果见表2。
2.1.3 回归方程的建立与显著性分析
以麦角甾醇含量(Y)为响应值，对表3数据进行回归分析，得到回归方程为:
表2 响应面设计方案及实验结果Tab.2 Box-Behnken design arrangement and experimental results
对方程进行分析，结果见表3。回归模型的F=3.83，P=0.045 3，说明模型显著;失拟项F=2.06，P=0.248 7，说明失拟项不显著。R2=0.8311，R2Adj=0.614 0，该回归方程可以用来确定最佳提取工艺。方差分析结果表明，A2，B2对麦角甾醇含量影响显著。
表3 回归分析结果Tab.3 Results of regression analysis
图1～图3反映了各因素的交互作用对响应值的影响，等高线图中椭圆在范围内，响应面呈凸面，故可以确定最佳工艺点。从响应面图可以看出转速和剪切时间对麦角甾醇得率的影响差不多，但比液料比显著。
图1 Y=f1(A，B)等高线图和响应面图Fig.1 Contour plot and response surface plot of Y=f1(A，B)
图2 Y=f2(A，C)等高线图和响应面图Fig.2 Contour plot and response surface plot of Y=f2(A，C)
图3 Y=f3(B，C)等高线图和响应面图Fig.3 Contour plot and response surface plot of Y=f3(B，C)
2.1.5 最佳工艺条件
由Design Expert软件分析得到最优工艺条件为转速9 098 r/min、液料比 25∶1(mL∶g)、剪切时间 9 min，预测麦角甾醇得率为0.073 5%。考虑到实际操作的局限性，确定最佳工艺条件为转速8 400 r/min、液料比25∶1(mL∶g、剪切时间9 min。在此条件下进行验证实验，结果麦角甾醇得率为0.072 1%。从结果可见，此回归方程是可靠的，采用响应面分析法优化麦角甾醇提取工艺条件是可行的。
2.2 GC-MS分析
经GC-MS分析，图4中保留时间6.688、6.816、7.061、7.727、8.084 min的峰通过与数据库匹配，结果见表4。
图4 灵芝醇提总甾醇的总离子流图Fig.4 Totalionchromatogramof the ethanol extracts from Ganoderma
表4 灵芝甾醇提取物中的主要成分Tab.4 The major components of sterol inGanoderma
2.3 TLC分析
图5是在254nm下观察的结果，从图5上可以看出灵芝总甾醇提取物中主要含有麦角甾醇。
图5 灵芝醇提物的TLC(左为麦角甾醇标准品，右为灵芝总甾醇醇提物)Fig.5 The TLC of ethanol extracts from Ganoderma(Left for ergosterol standard，right for the ethanol extracts from Ganoderma)
2.4 抗氧化实验结果与分析
2.4.1 清除DPPH·的结果与分析
从图6可见，灵芝总甾醇提取物浓度在1 000 μg/mL时，对DPPH·的清除率达95.16%稍低于Vc(96.66%)。
2.4.2 清除ABTS+·的结果与分析
图6 灵芝总甾醇提取物对DPPH·的清除能力Fig.6 The scavenging activity of the ethanol extracts from Ganodermatotal sterol against DPPH·
从图7可见，灵芝总甾醇提取物浓度在100 μg/mL时，对ABTS+·的清除率为29.46%高于VC对ABTS+·的清除率(21.39%);浓度在1 000 μg/mL时，对 ABTS+·的清除率达 81.33%低于 VC(94.44%)，其增长趋势依然明显，而VC趋缓。
图7 灵芝总甾醇提取物对ABTS+·的清除能力Fig.7 The scavenging activity of the ethanol extracts from Ganodermatotal sterol against ABTS+·
2.4.3 清除羟自由基的实验结果与分析
从图8可见，灵芝总甾醇提取物浓度在200 μg/mL时，对·OH的清除率为13.83%低于VC对·OH的清除率(15.33%);浓度大于200 μg/mL时，对·OH的清除率大于VC，其增长随着浓度的的增加而显著增加，而VC增长缓慢。浓度在1 000 μg/mL时，灵芝总甾醇提取物对·OH的清除率达55.41%。相比较DPPH·和ABTS+·的清除率，灵芝总甾醇提取物清除·OH的能力较弱。
2.4.4 还原力实验结果与分析
从图9可见，灵芝总甾醇提取物浓度在500 μg/mL以下时，还原力高于VC;浓度达到500 μg/mL以上时，还原力低于VC;浓度为1 000 μg/mL时，还原力吸光度达1.746，VC还原力吸光度为2.139。
3 结论
图8 灵芝总甾醇提取物对·OH的清除能力Fig.8 The scavenging activity of the ethanol extracts from Ganodermatotal sterol against·OH
图9 灵芝总甾醇提取物的还原力Fig.9 The reducing power of the ethanol extracts from Ganodermatotal sterol
本研究采用闪式提取法分离灵芝中的甾醇，经TLC和GC-MS分析都表明灵芝总甾醇提取物中含有大量麦角甾醇。通过响应面设计优化，确定了最佳提取工艺为:转速8 400 r/min，液料比25 mL/g，剪切时间9 min。在此条件下麦角甾醇实际得率为0.072 1%。总甾醇提取物对DPPH·的清除率为95.16%，对ABTS+·的清除率为81.33%，对·OH的清除率为55.41%，还原力吸光度为1.746，表明其具有较强的体外抗氧化能力。相对于传统的甾醇提取工艺，闪式提取技术所需提取时间更短、温度更低，在维持天然产物的生物活性上更有优势。采用管线式高速剪切提取装置后可以实现连续提取，易于工业化放大。
［1］Lv Guang-ping，Zhao Jing，Duan Jin-ao，et al.Comparison of sterols and fatty acids in twospecies ofGanoderma［J］.Chemistry Central Journal，2012，6:10.
［2］邓海林，吴佩颖，王建新.灵芝的研究进展［J］.时珍国医国药，2005，16(2):141－143.
［3］牛君仿，方正，王红庚等.灵芝有效化学成分研究进展［J］.河北农业大学学报，2002，25(zl):51－54.
［4］JianPing Yuan，JiangHai Wang，Xin Liu.Distribution of free and esterified ergosterolsin the medicinalfungusGanodermalucidum［J］.ApplMicrobiolBiotechnol，2007，77:159－165.
［5］陆慧，贾晓斌，陈彦，等.灵芝甾醇类活性成分及其抗肿瘤作用机制的研究进展［J］.中华中医药杂志，2011，26(2):325－329.
［6］赵洪波，矫黎东，王赛贞，等.灵芝甾醇对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用［J］.中国神经免疫和神经病学杂志，2005，12(2):114－117.
［7］张萱.灵芝活性成分的提取工艺及抗肿瘤成分的研究［D］.天津:天津大学，2006.
［8］弓晓峰.黑灵芝元素形态、活性成分及其保健功能研究［D］.南昌:南昌大学，2006.
［9］李丽，刘晔玮，赵剑喜，等.高速剪切技术破碎油菜蜂花粉细胞壁工艺［J］.食品科学，2012，33(12)，97－101.
［10］李丽，卜令娜，刘晔玮等.高速剪切技术提取油菜蜂花粉总黄酮工艺［J］.食品工业科技，2012，33(13):285－287，372.
［11］何胜华，马莺，李海梅，等.菜籽植物甾醇的分析鉴定及其标准品的制备［J］.食品工业科技，2005(10):172－174.
［12］MarijanaKosani，BranislavRankovi，JelenaVukojeviAntioxidant properties of some lichen species［J］.Food Sci Technol，2011，48(5):584－590.
［14］Huang Xiao-qin，Tu Zong-cai，Jiang Ying，et al.Dynamichighpressuremicrofluidization-assistedextractionandantioxidantactivitiesoflentinan［J］.International Journal of Biological Macromolecules，2012，51:926－932.
［15］傅茂润.黄花菜的抗氧化特性研究［D］.杭州:浙江大学，2009.
