重组大肠杆菌KO11利用单糖发酵乙醇条件优化*

王浩袭，王鹏，王静，牟海津

(中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛，266003)

随着化石能源的枯竭与环境污染的加剧，寻找替代能源是解决人类能源问题的必经之路。生物乙醇是可再生能源，比化石能源更清洁［1］，其生产原料来自淀粉质、糖质、纤维质等。目前生物乙醇主要使用玉米、甘蔗渣等为原料，但用其生产的乙醇成本高，并会产生食品安全威胁，限制了生物乙醇的发展［2］。纤维质来源广泛，价格低廉，具有生产生物质乙醇的巨大潜力，其主要成分为纤维素、半纤维素、木质素［3］，以及少量果胶、灰分等［4］。纤维素最终水解产物为葡萄糖，半纤维素水解后主要得到木糖［5］和少量的甘露糖、半乳糖、鼠李糖等还原糖。如果将半纤维素降解的糖发酵生成乙醇，可提高纤维燃料乙醇转化率［6］。有些自然界的细菌能发酵五碳糖，但其发酵产物中乙醇仅占很小比例［7］，如大肠杆菌(Escherichia coli)含有代谢戊糖的磷酸戊糖途径的整套基因与酶，可以代谢戊糖与己糖，但乙醇产量很低。Ohta等［8］利用Zymomonas mobilis中的pdc与adhB基因构建pet(production of ethanol)操纵子，导入到 E.coli中，得到能够同时高效利用葡萄糖与木糖的重组大肠杆菌KO11，是发酵混合糖的理想菌株［9］。为了对KO11进行更好的利用，本实验重点从温度、pH、振荡方式等方面对KO11的发酵条件进行了优化，将其利用碳源情况与酵母菌进行了比较，并研究了其发酵混合糖情况与糖浓度耐受性，可为纤维素和半纤维素的乙醇共发酵提供工艺指导。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

重组大肠杆菌E.coli KO11(以下简称KO11)，购买自 ATCC○R55124(American Type Culture Collection);酵母AN1#(Saccharomyces cerevisiae，以下简称AN1#)，本实验室保存。

1.1.2 培养基

固体培养基:LB固体培养基，葡萄糖20 g/L，胰蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 10 g/L，琼脂15 g/L，pH 7.0，氯霉素40 mg/L;PDA固体培养基，土豆200 g/L，葡萄糖 20 g/L，琼脂 15 g/L。

液体培养基:LB培养基，糖20 g/L，胰蛋白胨10 g/L，酵母膏 5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0;酵母培养基，糖20 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母膏5 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.3 g/L，NH4Cl 2 g/L。

培养基均采用115℃灭菌30 min。

1.1.3 仪器

雷磁pHS－25数显pH计，上海精密科学仪器有限公司;UV－2000型可见分光光度计，尤尼柯(上海)仪器有限公司;SBA－40C生物传感分析仪，山东省科学院生物研究所;DNP－9052型电热恒温培养箱，上海精宏实验设备有限公司;HZQ－C型空气浴振荡器，哈尔滨市东明医疗仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 菌种活化与种子液准备

KO11与AN1#接种于新鲜斜面后分别在35℃与30℃培养24 h，活化3次后取一环转接入液体培养基中，分别在35℃与30℃，150 r/min振荡培养12～14 h，得到种子液。

1.2.2 发酵

发酵均在250 mL锥形瓶中进行，每瓶装液量100 mL。接种4%(v/v)预先培养好的种子液，KO11于35℃、AN1#于30℃，150 r/min振荡培养，定时取样检测。实验均为3个平行。

1.2.3 测定方法

菌体生物量采用OD 600 nm比浊度法［10］测定;还原糖含量采用3，5－二硝基水杨酸比色定糖法(DNS 法)［11］测定;乙醇含量测定采用 SBA－40C 生物传感分析仪。乙醇转化率计算公式如下［12］:

2 结果与讨论

2.1 KO11与AN1#酵母的生长、乙醇产量与糖利用比较分析

将KO11与AN1#接种于以葡萄糖、木糖为碳源的液体培养基中，分别于35℃与30℃振荡培养，定时取样测定细胞生长情况、乙醇含量与残糖量，绘制相应曲线，结果见图1。

从图1(A)可知，KO11振荡培养至5 h时开始进入对数生长期，大约14 h时生长速度开始减慢，进入稳定期，因此KO11培养至10～14 h是最佳接种期;AN1#从7 h左右进入对数生长期，15 h进入稳定期，AN1#适应期较长，但增殖迅速;糖含量的变化与菌体生长情况联系紧密，菌体进入对数生长期前糖含量有少量消耗，进入对数生长期后即被迅速消耗，当被消耗殆尽后菌体没有充足的营养来源提供其生长繁殖，即进入衰退期;2株菌的乙醇转化曲线相似，在菌体进入对数期后即迅速增长，其中KO11在24 h达到最高值840 mg，乙醇转化率为82.35%，AN1#在26 h达到最高产值850 mg，乙醇转化率为83.33%，之后均略有下降，因此24、26 h分别为KO11、AN1#发酵葡萄糖产乙醇的理想测量时间点。从图1(B)可以看出，KO11利用木糖的菌体生长曲线相对于葡萄糖的略微滞后，8 h进入对数期，23 h进入稳定期;27 h转化木糖生成780 mg乙醇，达到最大乙醇转化率为84.78%，与利用葡萄糖的乙醇转化率相似;KO11对木糖的利用速度较慢，33 h以后才基本消耗完全;AN1#不能利用木糖转化生产乙醇，并且其菌体浓度一直维持在非常低的水平，无法大量增殖。

这些结果表明，KO11在发酵纤维质水解产物产乙醇的工艺中比酵母菌更有潜力。

图1 KO11与AN1#分别以葡萄糖(A)、木糖(B)为碳源时菌体浓度、乙醇产量与残糖量随时间变化情况Fig.1 Changes of the cell concentration，ethanol yield and residual sugar based on glucose(A)and xylose(B)by KO11 and AN1#

2.2 KO11利用不同单糖发酵产乙醇

虽然将纤维质原料转化为生物乙醇具有很大的潜力，但是要想实现工业化生产，还有很多瓶颈问题亟需解决，例如缺乏能够同时高效利用纤维素类水解物(主要是葡萄糖与木糖)的发酵菌株，成为制约纤维素乙醇生产的关键因素之一，因此构建高效的基因工程菌成为了研究热点。通过基因重组得到的E.coli KO11能够利用葡萄糖与木糖发酵产乙醇，对发酵液中的抑制物也有相对高的耐受性［13］。为了更全面分析其对单糖的乙醇转化能力，本实验分别向含有不同种类还原糖(初始糖浓度均为20 g/L)的LB培养基中接种KO11种子液，于35℃振荡培养，发酵结束后取样测定乙醇转化率与糖残留率，结果如图2所示。可以看出，KO11分别以岩藻糖、鼠李糖、半乳糖、甘露糖、木糖、葡萄糖为碳源发酵时，24 h的乙醇转化率能够达到 66.49%、15.49%、76.53%、78.10%、84.78%、82.35%，糖利用率除鼠李糖外均达到90%以上，并且糖残留率大小与乙醇转化率趋势呈负相关性;48 h时虽然各种糖残留率均有下降，但是除鼠李糖组以外其他各组的乙醇转化率也开始下降，导致乙醇产量的损失。其中，KO11在24 h时利用木糖与葡萄糖发酵的乙醇转化率达到80%以上，利用半乳糖与甘露糖的乙醇转化率稍低，达到75%以上，利用岩藻糖的则高于65%。鼠李糖能够被KO11利用进行代谢，但是不能被很好转化为乙醇，相反，其他5种糖则可以被高效转化为乙醇，尤其是在纤维质中的主要组成单位葡萄糖与木糖，葡萄糖能够在24 h基本被利用完。相比于大多数乙醇发酵菌种，KO11能够利用多种还原糖进行乙醇转化，具有较好的转化生物乙醇的潜力。

图2 KO11在24 h与48 h利用单糖的乙醇转化率与糖残留率Fig.2 Ethanol production rate and sugar consumption rate by strain KO11 at 24 h and 48 h

2.3 pH对KO11发酵乙醇的影响

E.coli的 pH值适应范围狭窄而中性(6.0～8.0)［14］，可能在适应性方面成为其基因改造后的缺陷。为揭示不同pH值对KO11发酵糖产乙醇的影响，本文采用添加不同pH值的磷酸盐缓冲液的方式调节发酵液pH值，对KO11发酵性能进行考察。配制0.2 mol/L不同pH值的磷酸盐缓冲液，10倍稀释加入发酵液中。不同pH值对KO11利用葡萄糖(发酵24 h)、木糖(发酵27 h)转化乙醇的影响情况见图3，可以看出KO11乙醇转化率受发酵液pH值的影响明显:加入pH 5.5的缓冲液组KO11的乙醇转化率均为最高，分别达到88.39%与88.11%。葡萄糖为底物时，乙醇转化率随着pH值的升高而降低，当pH为7.5时，乙醇转化率仅有77.36%;木糖为底物时，乙醇转化率在pH为6～7时较接近，继续升高pH到7.5时乙醇转化率较大幅度降低至79.43%。图中糖利用率的曲线说明97%以上的糖能够被KO11利用，糖利用率随着pH值的升高而升高，不过利用率的升高并没有导致乙醇转化率的升高。纤维质的糖化效率是发酵乙醇的关键环节，很多商品酶的最适pH介于5～6［15］，选择pH 5.5有利于将KO11发酵条件与酶解更好衔接。

图3 pH对KO11利用葡萄糖、木糖产乙醇的影响Fig.3 Effect of pH on ethanol production by strain KO11 based on glucose and xylose

2.4 温度对KO11发酵乙醇的影响

向添加pH 5.5缓冲液的发酵培养基中接种KO11，于不同温度下振荡培养，结束后取样分析乙醇转化率。结果如图4所示。KO11最适发酵温度为37℃，与文献报道一致［16］，发酵葡萄糖的乙醇转化率最高达到90.55%，发酵木糖的乙醇转化率最高达到90.12%。温度继续升高，乙醇转化率开始下降，至43℃时，乙醇转化率分别能达到79.88%(葡萄糖)、80.07%(木糖)，表明KO11在43℃以内具备较高的乙醇转化能力，有一定的耐高温发酵性能，但继续升温至45℃时乙醇转化率明显下降。糖的利用率与乙醇转化率的趋势相同，在37℃达到最大，当温度超过43℃后明显下降。在同步糖化发酵过程中，由于发酵菌种的最适温度与酶的最适温度存在差异，从而影响酶的糖化效率［17］，较低的发酵温度会抑制酶活，导致发酵时间的延长［18］，因此，筛选耐高温菌种可以在一定程度上解决酶的最适温度与发酵温度不协调的矛盾［19］。一般乙醇发酵菌种的发酵温度低于40℃，如Kadam等报道40℃时用酿酒酵母发酵稀H2SO4预处理的白杨木时，只有73%的乙醇转化率，具有耐高温特点的Candida acidothermophilum的乙醇转化率则能够达到80%［20］。

图4 不同温度对KO11利用葡萄糖、木糖产乙醇的影响Fig.4 Effect of temperature on ethanol production by strain KO11 based on glucose and xylose

2.5 振荡方式对KO11发酵乙醇的影响

一定的溶氧量有利于菌体的生长与代谢，实验室往往采用一定转速的振荡方式提供氧气，并提高菌体与碳源接触的均匀程度，但过量氧气也会导致菌体过度生长，消耗大量底物，从而降低乙醇的产量。乙醇发酵的代谢方式为厌氧代谢，氧气的增加可能会导致碳源代谢流向的改变，为了使产物合成速率与比速率达到最大值，需要维持呼吸临界溶氧浓度［21］。本实验通过改变连续振荡时间控制供氧量，考察对KO11乙醇发酵的影响。向添加pH 5.5磷酸缓冲液的培养基中接种KO11，于37℃振荡培养不同时间后取出静置于37℃恒温培养箱，每隔一定时间取样分析乙醇转化率与残糖量，结果如图5所示。从图5(A)可以看出，以葡萄糖为碳源时，振荡4 h后静置组在24 h(振荡4 h，静置20 h)可达到最高产率94.81%，振荡6 h后静置组与振荡8 h后静置组比前者略低，振荡12 h后静置组则产率偏低，说明较多溶氧对KO11利用葡萄糖进行乙醇发酵不利;葡萄糖利用率曲线显示，静置组的糖利用较慢，到48 h时尚未利用完全，振荡4 h后静置组与振荡6 h后静置组在24 h时将糖利用完，振荡8 h后静置组与振荡12 h后静置组则在12 h时即将葡萄糖利用完，说明振荡时间的延长可以明显促进菌体对葡萄糖的利用，但乙醇产量会随振荡时间的延长先增大后减少，只有提供合适的溶氧量才能将糖有效地转化为乙醇，因此不可盲目延长振荡时间。从图5(B)可以看出，发酵木糖时，随着振荡时间的延长，各组的最高乙醇转化率不断升高，振荡12 h后静置组在27 h得到了最高乙醇转化率94.15%，此时木糖基本被完全利用，继续延长振荡时间并不会有明显提高。KO11对木糖的利用速度明显比对葡萄糖的利用速度慢，需要更长的振荡时间来提高生物量，从而提高木糖利用率。实验结果表明到27 h时只有振荡12 h后静置组能够将木糖利用完全，说明KO11利用木糖产乙醇需要更长振荡时间。无论利用葡萄糖还是木糖发酵，静置组的糖利用速度都很慢，导致乙醇转化率也很低，说明发酵初始阶段为菌体的增殖提供氧气是必要的。

此结果可为利用KO11发酵含有木糖与葡萄糖的纤维质降解产物的实验提供参考，结合发酵液中碳源的情况选择合适的振荡时间。

2.6 KO11发酵混合糖产乙醇

Grootjen等［22］研究发现 Pichia stipitis和 S.cerevisiae在发酵葡萄糖与木糖混合糖时，菌种对木糖的乙醇转化能力受到葡萄糖浓度的影响很大，当葡萄糖浓度大于2.3 g/L时会明显抑制菌种对木糖的利用。由图6可知，葡萄糖对木糖发酵的确有一定程度的影响。0～16 h葡萄糖浓度大于4 g/L时，木糖仅利用了不到10%;16 h以后木糖开始被利用，从乙醇含量曲线可看出24 h时出现了拐点，葡萄糖利用完毕后KO11开始快速利用木糖，到48 h基本将木糖利用完全。KO11发酵混合糖时会优先利用葡萄糖转化乙醇，当葡萄糖浓度低于4 g/L时，木糖开始被明显利用，因此进行共发酵时需要选择合适的发酵工艺来缓解葡萄糖对木糖发酵的抑制作用。

2.7 KO11对糖浓度耐受性

追求尽量高的乙醇产量意味着需要不断追求更高的酶解率以提高糖浓度，但是在提高酶解液糖浓度的同时，也可能对微生物的新陈代谢产生不利影响［24］。过高浓度的糖液产生的高渗透压环境可能导致微生物不能生长代谢。因此需要对KO11的糖浓度耐受性进行考察。

将KO11接种于分别含有2%、5%、10%的初始葡萄糖浓度的发酵培养基中，于最佳条件下培养，定时测葡萄糖与乙醇含量，考察菌种对不同浓度葡萄糖的利用情况。结果如图7所示。由图可知，KO11在2%、5%的糖浓度下分别在24、32 h得到92%左右的乙醇转化率，在10%糖浓度下到60 h仍在缓慢增加，但是已经趋近最大，达到67%左右。结果表明，随着发酵液初始糖浓度的增大，KO11利用糖的时间延长，发酵时间也随之延长，在糖浓度5%以下KO11利用糖转化乙醇的能力相近，糖浓度增大到10%时，虽然能够将糖利用完全，但是乙醇转化率明显降低。

图5 不同振荡方式对KO11利用葡萄糖(A)、木糖(B)产乙醇的影响Fig.5 The effect of various agitating ways on ethanol production by strain KO11 based on glucose and xylose，respectively

图6 KO11利用混合糖(1.5%葡萄糖+0.5%木糖)时乙醇转化能力Fig.6 Ethanol conversion ability to utilize mixture sugars(1.5%glucose+0.5%xylose)by KO11

图7 KO11利用不同浓度葡萄糖(2%、5%、10%)的乙醇转化率Fig.7 Ethanol production rate fermented different concentration of glucose(2%，5%，10%)by KO11

3 结论

提高发酵乙醇转化率、扩大适用底物种类、更好衔接原料降解与发酵环节是利用纤维质进行生物乙醇转化的关键技术环节之一。本文通过对KO11发酵单糖条件的优化，对该菌种进行了更深入的研究，得出结论如下:(1)除葡萄糖与木糖外，KO11还能够高效利用岩藻糖、甘露糖、半乳糖发酵产乙醇，说明其与传统的酵母菌相比，具有更高的乙醇利用率;(2)KO11以葡萄糖为碳源时，在37℃，pH 5.5，150 r/min振荡4 h后静置发酵，在24 h能够得到最高乙醇转化率94.81%，以木糖为碳源时，在相同的温度、pH值、振荡速度下发酵12 h后静置，在27 h能得到最高乙醇转化率94.15%，KO11在43℃时仍具有较高的乙醇转化能力，可以在同步糖化发酵方式中提高体系温度，提高酶解效率，节约酶的使用量;(3)混合糖发酵时，KO11优先利用葡萄糖;(4)KO11有较高的糖耐受性，可以在高浓度酶水解液中发酵产乙醇。虽然目前利用运动发酵单孢菌(Z.mobilis)与大肠杆菌(E.coli)中构建木糖代谢途径的研究已取得显著进展，但在距离实际生产应用仍有较大差距。未来的菌种研究方向可以在以下几方面做出更大努力:通过基因改造获得更优良的纤维素水解酶生产菌种和戊糖发酵菌种，以及能够将生产酶与发酵结合起来的菌种，建立CBP工艺技术体系;进一步通过现代生物技术等手段提高菌种的乙醇耐受能力、纤维素水解物抑制物耐受能力(如呋喃甲醛等)、温度适应性和pH适应范围等。

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