广东地区GNB3基因多态性与原发性高血压遗传易感性研究

李海燕 黄旭琳 黄梓杨 陈少莲 张咏莉

近几年来对GNB3基因多态性与高胆固醇血症、冠心病、高血脂等关系的研究已成为国内外关注热点。研究GNB3基因多态性与心血管疾病遗传易感性将有助于了解GNB3基因在不同人群中分布情况，探索疾病的发病机制。有研究显示，GNB3 A(-350)G多态性可影响到G2蛋白活性。近年报道GNB3的基因A(-350)G多态性与EH的关系，结果不一致。对德国[1]、澳大利亚人的一些研究报道A(-350)G多态性与EH 有关联[2]，而来自日本[3]、法国、美国等的一些研究报道则无关联。到目前为止还未见到关于广东地区GNB3基因多态性与心血管疾病遗传易感性的研究报道，研究广东地区GNB3基因多态性与心血管疾病遗传易感性并与其他国家和地区人群对比，可以找到广东地区人群中与心血管疾病遗传易感性相关的GNB3基因型，对广东地区心血管疾病做出尽早的预防、诊断和治疗。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2010年在广东药学院第一附属医院采集原发性高血压患者血样50份，均符合世界卫生组织高血压诊断标准，相互之间无血缘关系。

1.2 基因组DNA制备

1.2.1 采用传统的酚-氯仿抽提法。

1.2.2 利用RNA/DNACalculator对所提DNA的质量和浓度进行测量。

1.3 GNB3 A(-350)G位点PCR反应

1.3.1 引物序列

上游5ˊ-AGA GGA TGG TGG GGT TGG GAG G-3ˊ

下游5ˊ-GAG GCT GTG AAA GCA GGG GTC AG-3ˊ

1.3.2 PCR反应体系

反应体系为 50 μl:4 μL DNA 溶液，2.5 U Taq 酶，引物工作液浓度每条为0.4 μM，dNTPs每种终浓度0.2 μM，标准的PCR buffer。

1.3.3 PCR反应条件

预变性 95℃ 5 min，后94℃ 60 s，60℃ 45 s，72℃ 60 s，共35 个循环，72℃ 7 min，4℃保存。

1.3.4 琼脂糖电泳:

PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳(离子强度0.5×TBE)，100V恒压电泳30 min及凝胶自动成像分析系统检测结果。A(-350)G扩增片段长度361bp，约61bp处为本研究观察G→A突变点。

1.4 测序反应

1.4.1 PAG凝胶配制和灌胶 配制含7 mmol/l尿素的6%变性聚丙烯酰胺凝胶;将洗净晾干的凝胶板装上胶架，放置夹紧。量取50 mlPAG胶液，加入10%过硫酸胺260 μl，TEMED 25 μl，混匀后缓慢灌入胶板中，静止凝固大约3 h。

1.4.2 样品处理 取12 μl去离子甲酰胺和0.5 μl PE GeneScan400 hD分子量内标，按上述比例混合成Loading Buffer;取7 μl Loading Buffer加入1 μl PCR 扩增产物(1/8 稀释)，混匀离心，然后于PCR仪上95℃变性4 min，后马上置于冰上，直至上样。

1.4.3 测序凝胶电泳 打开计算机和DNA自动测序仪主机，放置凝胶板。若玻板检测合格，倒入电泳液进行预电泳。停止后点样。用ABI PrismTM 310 Collection软件收集数据。电泳条件为1000V，30W，电泳2 h。

2 结果

2.1 人类基因组DNA提取 共提取正常人群和原发性高血压患群人类基因组样品100份。

2.2 GNB3 A(-350)G位点的PCR反应 各样品PCR反应琼脂糖电泳图如下。

2.3 GNB3 A(-350)G位点PCR产物测序反应

2.3.1 广东地区正常人群GNB3 A(-350)G位点测序结果正常人50份样品无一例突变，基因型均为GG，基因型频率100%。如N-10样品GNB3 A(-350)G碱基序列:

GCACTGACCCTCTCTCCGTCTGTGCATAAGGTCGTGAA

GATCT CTCAG CCAGG GGCCA GTCGA GTGTA TCACA GATTC TGTGA

2.3.2 广东地区原发性高血压患群GNB3 A(-350)G位点测序结果 患者45份样品，有2例D-10和D-50发生了G→A突变，基因型为GA，基因型频率4.4%。如D-10样品G→A突变碱基序列:

CAATGGCTCTCTCTCAGTCTGTGCATAAGGTCGTGAA

GATCT CTCAG CCAGG GGCCA GTCAA GTGTA TCACA GATTC TGTGA

2.3.3 N10和D10样品测序图如下。

2.4 GNB3 A(-350)G位点统计学分析

表1 GNB3 A(-350)G位点等位基因频率结果

表2 GNB3 A(-350)G位点基因型频率结果

3 讨论

原发性高血压是一种由多种遗传和环境因素共同作用所致的复杂的多基因疾病，而且遗传因素在高血压人群中可能起着重要的不可忽视的作用。近年来，寻找与高血压病有关及致病的相关基因越来越受到人们的关注。1998年，Siffert等发现G蛋白β3亚单位(GNB3)基因第10位外显子存在一个多态位点C825T。T等位基因使G蛋白过度活化，使得细胞Na+/H+交换(NHE)增强，Na+重吸收增加，容量扩张，导致血管强烈收缩及平滑肌增殖，使患高血压及高血压相关器官损害危险增加[4]。GNB3基因多态性与高血压的关系存在种族差异，对不同种族人群进行的研究结果不尽一致，我们的研究结果也显示GNB3基因A(-350)G多态性的变化存在着种族差异。由表1、表2可见，广东地区正常和患患者群G等位基因频率(1.000和0.978)显著高于非洲地区和德国地区正常人群G等位基因频率(0.76和0.61)，而A等位基因频率(0和0.022)显著低于非洲地区和德国地区正常人群A等位基因频率(0.24和0.39)，这可能与不同种族内心血管系统疾病患病率的高低存在相关性。所以在白人、黑人和东亚人群中GNB3基因A(-350)G位点等位基因频率是显著不同的，而亚洲人分布是否相似还有待于进一步深入研究。经过统计学分析，本次研究高血压组与正常血压组的GNB3 A(-350)G位点基因型与等位基因型无显著性差异，当然，为了进一步确定其关系，需要更多实验研究和更大的样本含量，并进行家族分析。

[1]刘文娟，杨文清，王蕾，等.β2肾上腺素受体基因、α上皮细胞钠通道基因和G蛋白β3亚基基因联合变异与维吾尔族人群高血压的关系.中国循环杂志，2009，24(6):446-450.

[2]Adam V，Benjadield，Chery，et al.G-protein β3 subunit gene(GNB3)variant in causation of essential hypertension.Hypertension，1998，32(5):994.

[3]Kato.Association study of G-protein β3 subunit.Hypertension，1998，32(5):934.

[4]韩璐璐，李娜，蒋雄京，等.GNB3基因C825T多态性与美托洛尔药效的相关性研究.中国新药杂志，2010，19(9).