注射用二丁酰环磷腺苷钙细菌内毒素检查法的可行性研究

王宗春,郭咸希

(武汉大学人民医院药学部,湖北 武汉 430060)

0 引言

注射用二丁酰环磷腺苷钙为淡黄色块状物或粉末,临床主要用于心绞痛、急性心肌梗死的辅助治疗,也可用于治疗心肌炎、心源性休克、手术后网膜下出血和银屑病,并可辅助其他抗癌药治疗白血病.

热原是引起临床输液反应的主要原因,必须严格控制静脉给药注射液的热原,中国药典关于注射剂控制热原方法有家兔法和细菌内毒素检查法(鲎试剂法)[1],后者具有灵敏度高、重现性好、简便易行等优点,已被各国药典所采用,目前尚少有该制剂采用鲎试剂法检查热原的报道,笔者应用鲎试剂法对注射用二丁酰环磷腺苷钙进行了研究,为该品种细菌内毒素检测方法的建立提供依据,旨在确保其临床用药的安全性.

1 材料与方法

1.1试验材料注射用二丁酰环磷腺苷钙4批次(上海第一生化药业有限公司,每瓶20 mg,批号分别为1110091、1203102、1205101、1209121);鲎试剂(厦门鲎试剂实验厂,规格0.1 mL,批号110124,灵敏度0.5 EU/mL);鲎试剂(湛江安度斯生物有限公司,规格0.1 mL,批号111207,灵敏度0.5 EU/mL);细菌内毒素工作标准品(中国食品药品检定研究院,每支10 EU,批号2011-07);细菌内毒素检查用水(厦门鲎试剂实验厂,每支2 mL,批号120307);SW-80A型旋涡混合器(上海医科大学仪器厂);微量取液器(50～250 μL)(上海金林生化试剂仪器厂);恒温水浴箱(江苏南通嘉程仪器有限公司);细菌内毒素检查用具(湛江安度斯生物有限公司).

1.2细菌内毒素备用液的配制将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解,在旋涡混合器上混匀15 min,配制成浓度为10 EU/mL的细菌内毒素溶液,备用.

1.3鲎试剂灵敏度试验将上述细菌内毒素备用液稀释成2.00、1.00、0.50、0.25λ4个浓度等级的内毒素标准溶液,每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30 s,每一浓度平行做4支,每管加入鲎试剂0.1 mL和内毒素标准溶液0.1 mL.同时用细菌内毒素检查用水做2支阴性对照管,共18管,轻轻混匀后,封闭管口,垂直放入(37±1) ℃恒温水浴箱中,保温(60±2) min,将反应管轻轻取出,缓缓倒转180°,观察结果,若管内形成凝胶,并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性(+);未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性(-).

1.4供试品最大不干扰浓度试验

1.4.1 预试验 用细菌内毒素检查用水将注射用二丁酰环磷腺苷钙溶解,并配制成浓度分别为80.0、40.0、20.0、10.0、5.0、2.5 mg/mL的倍比系列溶液(Negative Product Control,NPC),在每一浓度下加入细菌内毒素工作标准品溶液,使每一稀释浓度的供试品溶液中都含有1.0 EU/mL细菌内毒素(Positive Product Control,PPC)[2],取上述各溶液0.1 mL加入到已复溶的两个不同厂家生产的鲎试剂(λ为0.5 EU/mL)管内,每个浓度重复2管,设立阴性对照和阳性对照,按药典方法进行反应.

1.4.2 确证试验 根据预试验结果,取浓度为20 mg/mL的供试品溶液及BET水,加入细菌内毒素备用液,配制成细菌内毒素最终浓度分别为1.000、0.500、0.250 EU/mL的系列溶液,分别取0.1 mL加入到已复溶的两个不同厂家生产的鲎试剂管内,每个浓度平行做4管,另取供试品溶液做2支阴性对照管,进行供试品溶液(浓度为20 mg/mL)干扰确证试验[3-5].

2 结果与分析

2.1鲎试剂灵敏度试验结果2批鲎试剂的灵敏度试验结果显示,最大浓度2λ管均为阳性,最低浓度0.5λ管均为阴性,阴性对照管为阴性,厦门鲎试剂实验厂生产的鲎试剂(批号110124)灵敏度测定值λc=0.42,湛江安度斯生物有限公司生产的鲎试剂(批号111207)灵敏度测定值λc=0.50,均在0.5λ～2.0λ之间,说明2批鲎试剂其灵敏度均符合要求,可用于细菌内毒素的检查.

2.2 供试品最大不干扰浓度

2.2.1 干扰预试验结果 表1为干扰预试验结果,显示当浓度为80 mg/mL时,4个批号的供试品均对鲎试剂的凝集反应有抑制作用,浓度为40 mg/mL时部分批号的供试品对凝集反应有抑制作用,而当浓度等于或低于20 mg/mL时抑制作用消失,可以初步判断供试品最大不干扰浓度为20 mg/mL.

2.2.2 干扰确证试验结果 根据干扰预试验结果,选择浓度为20 mg/mL的供试品溶液进行干扰确证试验,结果见表2、3.Et为用供试品溶液制成的内毒素标准溶液反应终点浓度的几何平均值,Es为用细菌内毒素检查用水制成的内毒素标准溶液反应终点浓度的几何平均值,结果显示Et/Es在0.5～2.0之间,按照中国药典判断标准,浓度为20 mg/mL的供试品溶液对鲎试剂与细菌内毒素之间凝集反应既无抑制作用,也无增强现象,说明供试品最大不干扰浓度为20 mg/mL.

表1 供试品干扰预试验结果

“+”表示反应呈阳性;“-”表示反应呈阴性(下同).

表2 供试品(20 mg/mL)干扰确证试验结果(鲎试剂批号110124)

表3 供试品(20 mg/mL)干扰确证试验结果(鲎试剂批号111207)

2.3 注射用二丁酰环磷腺苷钙细菌内毒素检查法的确定

2.3.1 细菌内毒素限值(L)的计算L=K/(M·f)[6],M为人用最大供试品剂量,按照注射用二丁酰环磷腺苷钙说明书,成人1次最大剂量为2支(40 mg),溶解于5%葡萄糖注射液,静脉滴注,M=40÷(60×1)=0.667 mg·kg-1·h-1(人均体重按60 kg计算,滴注时间以1 h计);式中K为人每千克体重每小时最大可接受的细菌内毒素剂量,中国药典规定注射剂K=5 EU·kg-1·h-1;f为安全系数,由于本品主要用于心绞痛、急性心肌梗死等疾病的治疗,同时考虑到葡萄糖注射液也含有细菌内毒素,为了严格控制热原,将安全系数f定为3.0,则本品的细菌内毒素限值L=5.0/(0.667×3.0)=2.5 EU/mg.

2.3.2 供试品有效稀释浓度(C) 供试品有效稀释浓度C=λ/L,L为细菌内毒素限值(2.5 EU/mg),λ为鲎试剂灵敏度(0.5 EU/mL)时,对应的C为0.2 mg/mL.

2.3.3 供试品细菌内毒素检查法 由于供试品有效稀释浓度C为0.2 mg/mL,远小于该品的最大不干扰浓度(20 mg/mL),当某一浓度的供试品对凝集反应不存在干扰作用时,比该浓度低的供试品也一定不存在干扰作用[6],因此可以将供试品用细菌内毒素检查用水溶解并稀释至浓度为0.2 mg/mL,依中国药典2010年版(二部)附录细菌内毒素检查法检查,细菌内毒素限值定为2.5 EU/mg.

3 讨论

鲎试剂是目前国际上公认的细菌内毒素检测用试剂,可用于放射性、生物制品、化学药及中药等药物的灭菌制剂细菌内毒素检测,但由于很多药品对鲎试剂与细菌内毒素之间的凝集反应具有抑制或增强的干扰作用,出现假阳性或假阴性现象,限制了鲎试剂的应用,只有证实供试品在有效稀释浓度范围内对凝集反应无干扰,鲎试剂方法的结果方能有效可信.本研究的干扰预试验显示,高浓度(80 mg/mL)的二丁酰环磷腺苷钙溶液会抑制鲎试剂与细菌内毒素之间的凝集反应,但通过稀释至浓度为20 mg/mL时干扰作用消失,并通过干扰确证试验得到验证,即该品的最大不干扰浓度为20 mg/mL.

按照中国药典2010年版(二部)附录计算得到注射用二丁酰环磷腺苷钙的细菌内毒素限值为2.5 EU/mg,当使用灵敏度为0.5 EU/mL的鲎试剂时,对应的供试品有效稀释浓度为0.2 mg/mL,低于最大不干扰浓度(20 mg/mL),因此使用鲎试剂法检测该品的细菌内毒素是可行的.

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版二部[S].北京:中国医药科技出版社,2010:附录99-101.

[2] 王宗春,张洪,姜俊勇.鲎试剂方法检测胎盘多肽注射液中细菌内毒素[J].湖北大学学报:自然科学版,2011,33(2):190-192.

[3] 蔡彤,张国来,李波,等.84种注射用药品细菌内毒素检查法的方法学研究[J].中国药学杂志,2010,45(2):150-155.

[4] 潘卫松,肖瑛,潘建明.荧光素钠注射液细菌内毒素检查法的研究[J].中国药房,2009,20(13):1010-1012.

[5] 李浩,李健和,叶清.尼扎替丁氯化钠注射液的细菌内毒素检查[J].中国药业,2009,18(4):38-39.

[6] 黄清泉,夏振民.药品细菌内毒素检查的实验设计[J].中国药学杂志,1997,32(2):72-74.