KATP通道基因多态性与2型糖尿病及磺脲类药物疗效的相关性

邵 倩 班 博 施锦绣 张 梅 孙海玲 (山东大学研究生院，山东 济南 500)

2型糖尿病(T2DM)是一种由遗传因素和环境因素共同作用的代谢性疾病，以胰岛素分泌及(或)作用受损为特征。研究发现ATP敏感性钾(KATP)通道在胰岛素分泌中起着重要作用〔1〕，胰岛β细胞膜上KATP通道是由磺脲类受体1(SUR1)及钾离子内向整流(Kir6.2)通道两种亚单位组成的八聚体，是胰岛素分泌的物质基础，通过将细胞膜电活动与细胞代谢联系起来，调控胰岛素的分泌。此外，KATP通道还是磺脲类药物作用的靶点〔2〕。SUR1由ABCC8基因编码，Kir6.2由 KCNJ11基因编码，目前ABCC8和KCNJ11基因已在包括亚洲人群在内的多个种族进行了广泛研究，并且证明和T2DM有关〔3，4〕，但是尚不清楚这种相关性是否也影响磺脲类药物疗效。本研究主要探讨在山东汉族人群中ABCC8、KCNJ11基因多态性与T2DM的相关性，并观察与磺脲类药物疗效的相关性。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2010年10月至2012年7月山东地区汉族人共300例为研究对象，其中T2DM患者(T2DM组)200例(男105例，女95例);正常对照组(NC组)100例(男53例，女47例)，为与病人无血缘关系的血糖正常者。T2DM的诊断依据1999年WHO标准;T2DM患者病例排除标准:①糖尿病急性应激状态如急性心肌梗死、脑卒中、糖尿病酮症酸中毒、糖尿病非酮症高渗性昏迷等;②明显的肝、肾功能异常者;③近期使用过影响肝、肾功能药物者。所有对象在知情同意的情况下，签署知情同意书。以磺脲类药物是否有效，将200例T2DM患者分为(SFS)组86例(男42例、女44例)，有效组114例(男63例，女51例)。SFS标准:曾经有至少3个月初始使用磺脲类(或联合二甲双胍)的有效期，在适当饮食、运动基础上，磺脲类加至每日最大剂量〔如格列苯脲(优降糖)15 mg、格列吡嗪(美吡达)30 mg等〕，失效持续1～3个月，尚未使用INS，空腹血糖＞10.0 mmol/L，糖化血红蛋白＞9.0%。磺脲类治疗有效标准:糖尿病饮食控制加磺脲类(或联合二甲双胍)空腹血糖＜9.0 mmol/L，糖化血红蛋白＜8.4%。两组胰岛细胞表面抗体(ICA)、胰岛素抗体(IAA)和谷氨酸脱羧酶抗体(GAD-Ab)均阴性。

1.2 研究方法

1.2.1 一般资料采集 收集所有入选对象的基本资料，包括年龄、性别、糖尿病病程、测量身高、体重，计算体质量指数=体质量/身高2(kg/m2)。采用全自动生化分析仪测定各组的血糖、糖化血红蛋白、血脂等指标，采用化学发光法检测T2DM组空腹C肽及标准馒头餐后2 h-C肽水平。

1.2.2 DNA提取 所有受检者取肘静脉血2 ml，用EDTA-K2抗凝，采用盐析法抽提基因组DNA(QIAGEN)，应用NanoDrop-1000(USA)检测其浓度和纯度后，稀释至30 ng/μl。

1.2.3 SNaPshot技术检测 (1)多重PCR扩增:PCR反应体系为 10 μl，含基因组 DNA 1 μl(30 mg/L)，0.3 μl的 dNTP(10 mmol/L)，1 μl 10 × PCR 缓冲 液，0.52 μl MgCl2溶 液(25 mmol/L)，0.1 μl HotStar(Sigma 公司)，6.68 μl无核酸酶的去离子水，各引物对的终浓度为0.1 μmol/L。多重PCR反应条件:95℃预变性15 min，94℃变性40 s，63℃退火1 min，每个循环下降0.5℃，72℃延伸1.5 min，15个循环;94℃变性40 s，56℃退火 40 s，72℃延伸 1.5 min，25 个循环;72℃8 min，4℃保存，PCR反应在9700热循环仪(ABI公司)中进行。(2)扩增产物的纯化:取1.0 μl扩增产物，加入2.0 U虾碱性磷酸酶(SAP 酶，USB，U.S.A)，2.0 U Exo I酶(Epicentre Biotechnologies，USA)，去离子水 2.6 μl，反应总体系为 6 μl，混匀后 37℃保温60 min，然后75℃灭活15 min，4℃保存。(3)延伸标记、纯化，反应体系为 5 μl，含纯化物 2 μl，SNaPshot Multiplex Mix(ABI公司)0.5 μl，去离子水 1.3 μl，每种引物在反应体系中的终浓度分别为0.2 μmol/L。PCR循环条件为:96℃预变性10 s，96℃变性 10 s，50℃(53 C)退火 5 s，60℃ 延伸 30 s，25 个循环，PCR反应在9700热循环仪(ABI公司)中进行。反应结束后进行第2次纯化，每反应产物中加入1 U SAP酶，37℃保温60 min，75℃灭活15 min，4℃保存。(4)每反应体系中加入Hi-Di甲酰胺(ABI 公司)9.25 μl，内标 LIZ-120(ABI 公司)0.1 μl，第 2 次纯化产物 1 μl，混匀离心后，95℃ 变性 5 min，迅速冰冷4 min。于ABI公司3730遗传分析仪进行毛细管电泳，应用GeneMaperV4.0软件进行数据分析。在所有样本中，每一个SNP的基因分型成功率＞98%。在随机抽取的样本中所有的重复分型的一致率均为100%。

1.3 统计学分析 以Hardy-Weinberg平衡法检验研究样本的群体代表性，计数资料采用χ2检验。正态分布计量资料以s表示，偏态分布变量以中位数(25%位数，75%位数)表示，组间计量资料均数比较采用t检验，偏态变量在统计学处理前先经自然对数转换。多因素分析用Logistic回归分析，计算比值比(odds ratio，OR)及其95%置信区间(95%CI)。上述数据处理运用SPSS13.0统计软件。

2 结果

2.1 ABCC8基因rs1799854、KCNJ11基因rs5219基因型和等位基因分布 ABCC8基因rs1799854、KCNJ11基因rs5219分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律。ABCC8基因rs1799854位点基因型频率分布在NC组和T2DM组差异有统计学意义(P＜0.05)，且“t”等位基因在T2DM组显著高于NC组(P＜0.05，OR=1.59，95%CI=1.13 ～2.24)。KCNJ11 基因 rs5219基因型频率分布在NC组及T2DM组差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

2.2 NC组与T2DM组的临床资料比较 与NC组比较，T2DM组年龄、TG均明显高于NC组(P＜0.01)，HDL-C明显低于NC组(P＜0.01)。见表2。

表1 ABCC8基因rs1799854、KCNJ11基因rs5219基因型和等位基因分布〔n(%)〕

表2 T2DM组与NC组临床资料比较(s)

表2 T2DM组与NC组临床资料比较(s)

与NC组比较:1)P＜0.01

项目 NC组(n=100)T2DM组(n=200)53/47 105/95年龄(岁)51.69±7.85 56.46±9.051)BMI(kg/m2)25.43±3.33 25.20±2.91 TG(mmol/L)1.56±1.59 2.09±0.771)TC(mmol/L)5.08±0.97 4.90±1.01 HDL-C(mmol/L)1.63±1.39 1.23±0.221)LDL-C(mmol/L)男/女(n)2.89±0.87 2.81±0.72

2.3 ABCC8基因rs1799854、KCNJ11基因rs5219在磺脲类药物继发失效组及有效组基因型和等位基因分布 观察了200例应用磺脲类降糖药物患者，按其疗效分组，可见失效组和有效组间，ABCC8基因rs1799854基因型频率分布差异有统计学意义(P＜0.05)，且“t”等位基因在失效组明显高于有效组(P＜0.05，OR=1.87，95%CI=1.23～2.85);KCNJ11基因 rs5219基因型频率分布在失效组及有效组差异无统计学意义(P＞0.05)。见表3。

表3 ABCC8基因rs1799854、KCNJ11基因rs5219基因型和等位基因分布〔n(%)〕

2.4 ABCC8基因rs1799854在T2DM组不同基因型间临床资料比较 ABCC8基因rs1799854 t/t基因型SFS发生率、FPG、HbA1c、2 h PG显著高于 c/t+c/c型组(P﹤0.01)，而 BMI、2 h-C肽显著低于c/t+t/t组(P﹤0.01)。见表4。

表4 ABCC8基因外显子rs1799854不同基因型间临床资料比较(s)

表4 ABCC8基因外显子rs1799854不同基因型间临床资料比较(s)

与c/c+c/t组比较:1)P＜0.01

项目 c/c+c/t(n=121)t/t(n=79)64/57 41/38年龄(岁)57.05±9.89 55.66±7.55 BMI(kg/m2)25.72±2.99 24.41±2.591)病程(岁)6.00(2.00，10.00)7.00(3.00，14.00)SFS〔n(%)〕 40(33.1)46(58.2)1)HbA1c(%)8.84±1.43 9.70±2.081)FPG(mmol/L)9.24±2.42 10.54±3.741)2 h PG(mmol/L)17.79±3.67 19.33±3.811)F-C肽(mmol/L)2.11±0.67 1.99±0.69 2 h-C肽(mmol/L)7.20±2.56 6.09±2.241)男/女(n)

3 讨论

ABCC8基因是ATP结合盒(ABC)C亚单位8号成员，编码磺脲类受体1(SUR1)，KCNJ11基因是内向整流钾通道蛋白J亚单位11号成员，编码内向整流钾通道(Kir6.2)蛋白，二者均位于染色体11p15.1上，相距4.5 kb，4个SUR1亚单位围绕4个Kir6.2亚单位共同组成KATP通道，该通道在调节胰岛素的分泌中起着重要作用，其调控过程呈血糖依赖性，当血糖波动时，细胞内ATP/ADP比例改变，通过ABCC8基因及KCNJ11基因调节KATP通道的开关，进而影响胰岛素的释放〔5〕。

研究表明，ABCC8基因和KCNJ11基因与T2DM相关，ABCC8基因和KCNJ11基因的变异均可引起新生儿糖尿病及家族性持续性高胰岛素低血糖症〔6，7〕。目前文献报道，ABCC8基因某些位点的多态性与T2DM存在相关性，但在不同的人种结果往往存在差异性。在本研究中，rs1799854基因型分布在T2DM组与NC组差异有统计学意义(P＜0.05)，这与日本、土耳其、北欧白种人、中国北方人群的研究结果一致〔3，8～10〕，而与高加索人、中国南方人群的研究结果不一致〔11，12〕。KCNJ11 基因rs5219是在高加索人及亚洲人中研究最多的位点，研究证明在高加索人中rs5219与T2DM相关〔13～15〕，而在亚洲人的研究报道中结果不一。本研究发现山东汉族人群中rs5219在T2DM组与NC组基因型分布差异无统计学意义(P＞0.05)，这与日本、丹麦、中国安徽、青岛地区人群的报道相同〔3，16～18〕，而与中国南方人群的研究不同〔12〕。ABCC8及KCNJ 11基因多态性的分布由于环境、遗传背景不同可能在不同种族间存在差异，那么，如何解释中国人的基因分布在南北方人群中结果的差异呢?最近中国人类起源的遗传学研究发现中国人类起源于非洲，从南方进入中国，然后迁徙至北方〔19〕，在迁徙过程中可能以自然条件分割，形成了不同的隔离人群，如中国的黄河、长江等，不同的隔离人群其遗传物质可能是有差异的。

本研究显示，T2DM组年龄、TG显著高于NC组，而HDL-C显著低于NC组，在进行非条件多因素Logistic分析时，发现rs1799854 t/t基因型、年龄是 T2DM发生的独立危险因素，HDL-C与T2DM的发生呈负相关关系。这提示T2DM的发生拥有复杂的机制，可能是遗传因素与环境因素共同作用的结果。因此，对于年龄较大的人群更应该合理膳食，注意维持提质量、血脂等的正常，以减少危险因素的聚集。

磺脲类药物作为一种胰岛素促泌剂，通过与胰岛β细胞膜上的磺脲类受体结合，关闭细胞膜上ATP敏感性钾离子通道，使钾离子外流减少，细胞膜去极化，导致电压门控性钙通道开放，钙离子内流，促进胰岛素的释放。本研究发现ABCC8基因rs1799854多态性与SFS发生相关，且t等位基因分布频率在SFS组明显高于有效组，这与袁莉等〔20〕的报道一致。比较T2DM组rs1799854不同基因型，SFS发生率在t/t型组显著高于c/t+c/c型组，且t/t型组2h-c肽显著低于c/t+t/t型组，这与纪立农等〔21〕的研究报道一致。与此同时，HbA1c水平在t/t型组显著高于c/t+t/t型组，而在Nikolac等〔22〕的报道中，也发现在应用磺脲类药物治疗的T2DM患者，t/t型组HbA1c显著高于其他基因型组。

ABCC8基因rs1799854与SFS的关系少有报道，且具体机制尚不清楚，推测可能机制:(1)由于该突变位于外显子16剪切部位上游，在转录过程中，影响了正常的剪接，使SUR1功能受到影响，进而影响KATP通道，导致胰岛素释放障碍。(2)也可能与ABCC8基因上发生变异的其他功能性位点存在强烈的连锁不平衡〔3〕，影响胰岛素的分泌功能而导致SFS。(3)由于t/t型血糖控制较差，高糖毒性可能又反过来加重了胰岛分泌功能障碍，进一步影响药物疗效。

综上所述，ABCC8基因rs1799854可能是山东汉族T2DM人群的易感基因，并可能通过改变KATP通道功能而影响磺脲类药物疗效。由于T2DM的高度异质性及降糖疗效的显著差异，这一研究结果还需要在不同地域、不同种族的人群中进行大样本的重复来验证。

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