大鼠丘脑中央下核GABA纤维终末与腹外侧眶皮质投射神经元的突触联系*

罗阿丽，王唯析，强 辉，靳 辉，陈国敏

1)西安市结核病胸部肿瘤医院病理科 西安 710061 2)西安交通大学医学院人体解剖与组织胚胎学系 西安 710061 3)陕西省人民医院骨科 西安 710068

在镇痛的研究中，有学者[1]发现存在着脊髓-丘脑中央下核(thalamic nucleus submedius, Sm)-腹外侧眶皮层(ventrolateral orbital cortex, VLO)-导水管周围灰质(periaqueductal gray, PAG)-脊髓痛觉调制反馈环路，在该环路中，阿片和(或)5-羟色胺(5-HT)诱发的抗伤害性效应可能是通过抑制Sm内GABA能突触前终末对VLO投射神经元的紧张性抑制作用而实现的[2]，但缺乏GABA及其受体参与痛觉调制的形态学依据[3]。作者采用辣根过氧化物酶(HRP)逆行追踪方法、HRP组化和GABA免疫组化双标电镜技术观察Sm内GABA纤维终末与VLO投射神经元之间的突触联系，报道如下。

1 材料与方法

1.1实验动物健康SD大鼠18只，体质量160～180 g，雌雄各半，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。适应性喂养1周，10 g/L水合氯醛腹腔注射麻醉后，将大鼠置于脑立体定位仪上，参照Paxinos等[4]编制的大鼠脑立体定位图谱，切开颅顶皮肤及皮下组织，在前囟前3.2 mm、中线左旁2.0 mm处行颅骨钻孔，将微玻管(外径35 μm)插入脑表面下4.5～4.6 mm的VLO内，缓慢注射200 g/L HRP(Sigma公司)0.2 μL。48 h后过量水合氯醛腹腔麻醉，开胸经左心室插管，先以100 mL 温生理盐水冲洗血管，继而灌注500 mL 40 g/L多聚甲醛-0.75 g/L戊二醛-75 g/L苦味酸-0.1 mol/L磷酸缓冲液(PB)(pH 7.4)固定液，灌注速度先快后慢，持续约1 h。灌毕立即取脑，切取含注射部位和Sm的脑组织块，40 g/L多聚甲醛-0.1 mol/L PB(pH 7.4)固定液后固定4～6 h。置100～200 g/L蔗糖-PBS(4 ℃)中浸泡过夜，至脑块下沉至瓶底。振动切片机冠状连续切片，片厚50 μm。 Sm部位切片隔2张取1张，分3套收集于0.1 mol/L PB(pH 7.4)内，分别用于HRP组化染色、GABA免疫组化染色以及HRP组化-GABA免疫组化染色。

1.2HRP组化染色四甲基联苯胺(TMB，Sigma公司)-钨酸钠(ST)呈色，二氨基联苯胺(DAB)-Co+-H2O2加强染色，中性红复染。

1.3GABA免疫组化染色采用ABC漂浮染色法，其中GABA抗体(按11 000稀释)购自Sigma公司，生物素结合的羊抗兔IgG (按1200稀释)、ABC试剂盒购自Vector公司。染色步骤按说明依次进行，DAB显色，甲苯胺蓝复染。用PBS(pH 7.4)代替GABA抗体作为阴性对照。

1.4HRP组化-GABA免疫组化染色切片置于250 g/L蔗糖-100 g/L甘油-0.05 mol/L的PB(冰晶保护液，pH 7.4)中孵育0.5～1 h，移入液氮内快速冻融[5]后再放回冰晶保护液内。移切片入TBS(体积分数20%羊血清-0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液-0.09 g/L NaCl, pH 7.4)中孵育0.5 h。依次进行HRP组化染色、GABA免疫组化染色，锇酸固定、梯度乙醇脱水、环氧树脂浸透、修块、Epon812平板包埋、聚合、超薄切片、铀铅各染1 min等步骤。日本日立H-600 透射电镜下观察、拍照。

1.5数据处理每只动物选3张切片，应用Leica Q550CW图像分析系统在20倍视野下计数Sm内HRP阳性神经元、GABA阳性神经元及所有神经元，计算阳性神经元占神经元总数的比例。电镜下观察并计数轴-体突触、轴-树突触，计算相应比例。

2 结果

2.1HRP逆行追踪神经元的分布经TMB-ST染色后，见HRP标记的神经元分布于Sm(乳头体丘脑束背内侧部)内，反应产物呈蓝绿色、粗颗粒状；经DAB-Co+-H2O2加强染色后呈黑色，分布于神经元胞体及突起内，其中Sm腹侧部的阳性神经元数目明显多于背侧部。多数阳性神经元为多极神经元，大小不等、形态各异，可见数个短的阳性突起；少数为双极神经元，胞体多呈梭形(图1A)，约有60.24%的神经元被标记。

2.2GABA阳性神经元的分布光镜下，大鼠Sm内可见大量呈颗粒状的GABA纤维终末，免疫组化反应产物呈棕黄色。另可见少数散在的类圆形的GABA阳性神经元，该神经元突起短而少，胞质内有免疫反应产物，胞核及胞膜上未见明显着色(图1B)，推测其可能为GABA能中间神经元。该类神经元约占神经元总数的2.17%。

2.3双标电镜观察结果电镜下HRP反应产物为高电子密度的黑色团块状物，主要分布于神经元的核周质及突起内，神经胶质细胞内未见其分布，HRP阳性树突上有大量的树突棘。GABA反应产物为较高电子密度的小颗粒状物，主要分布于纤维终末胞质及突触囊泡内。GABA纤维终末与HRP神经元胞体及树突间建立了对称性或非对称性突触(图1C、D、E)。其中GABA纤维终末与HRP阳性神经元胞体所建立的突触均为对称性突触。 对称性突触表现为突触前、后膜基本对等增厚，突触间隙较窄，突触前膜内含有丰富的较小的扁平囊泡。非对称性突触表现为突触前、后膜厚度不一，突触后膜较厚，且膜下有致密物质附着，突触间隙宽于对称性突触，突触囊泡为稍大的圆形囊泡。

由于观察视野及标本数量受限，该实验在电镜下未观察到GABA免疫标记神经元。

图1 HRP标记及HRP-GABA双标电镜结果

作者观察到的48个轴突与HRP阳性神经元胞体形成的轴-体突触结构中，有11个(22.92%)GABA阳性轴突和HRP阳性胞体形成的突触，其突触类型均为对称性的，且在一个HRP阳性神经元切面上，可见到1～2个GABA阳性轴突终末与其形成突触。在62个轴突和HRP阳性神经元树突形成的轴-树突触结构中，有7个(11.29%)GABA阳性轴突与HRP阳性树突发生突触联系，其中对称性突触有3个，非对性的突触联系有4个。

3 讨论

3.1Sm内GABA能神经元及纤维终末的来源报道[6]称，大鼠Sm内无GABA能神经元，但该实验发现在大鼠Sm内散在分布少量GABA能神经元，推测其属于中间神经元，与上述报道不符。若要进一步证实，须借助免疫原位杂交、免疫荧光双标等方法进行辨别及确认。该研究发现Sm内含丰富的GABA纤维终末，与文献[6]相符。有文献[7-8]报道，丘脑网状核和外侧膝状体核有大量的GABA能神经元胞体，其发出的轴突主要投射到Sm及中央丘脑体感中继核，且在Sm内神经元胞体和神经毡上分布有GABAA、GABAB受体，推测大鼠Sm内的GABA能纤维终末可能主要来自丘脑网状核和外侧膝状体核，也可能来自Sm内固有GABA能神经元。

3.2Sm的纤维联系及其功能Sm内的传入和传出纤维联系十分广泛。在大鼠，Sm除接受脊髓背角Ⅰ层神经元的投射外，也接受来自Ⅴ～Ⅶ层的投射。大鼠Sm内神经元主要上行投射到同侧前额VLO，VLO又返回性地投射到同侧Sm并与体感皮层联系。研究[1]表明，Sm具有紧张性下行抑制作用，并且这些效应可通过毁损或抑制VLO或PAG所阻断。文献[9-10]报道在痛觉调制方面，Sm-VLO-PAG可能构成一个痛觉调制通路，伤害性刺激激活Sm，经VLO转而激活PAG，通过脑干下行抑制系统在脊髓水平调制伤害感受性输入，从而产生痛觉的负反馈性调节。Sm可能在传导针刺信息尤其是细纤维的传入信息和在脊髓水平以上产生镇痛具有重要意义[10]。

3.3Sm内VLO投射神经元的相关受体分布研究[7-8]证实，大鼠Sm内有丰富的GABA能纤维终末和GABAA、GABAB受体分布，但不清楚Sm内VLO投射神经元是否表达这些受体。实验[11-12]表明Sm内微量注射GABAA受体的拮抗剂荷包牡丹碱可剂量依赖性地抑制大鼠甩尾反射，这种效应可被阿片受体拮抗剂纳洛酮阻断。Sm内微量注射5-HT也可明显抑制大鼠甩尾反射，并被5-HT2受体拮抗剂所拮抗。Sm内有μ-受体[13]和5-HT受体[14]的分布，但不清楚Sm内GABA能突触前终末上是否有这些受体分布， 5-HT能亚受体在分布上有何差异，阿片肽和5-HT通过何种方式抑制GABA能突触前终末或递质的释放，这些问题都是阐明Sm-VLO-PAG痛觉调制通路发挥作用的关键问题。该实验证实了Sm内VLO投射神经元的胞体、树突周围存在GABA纤维终末，且它们之间建立了对称性和(或)非对称性突触联系，但在突触后膜上存在何亚型的GABA受体，GABA纤维终末是否还受5-HT能和(或)阿片能纤维终末的突触前调节，仍有待进一步探讨。

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