辣椒素对食管鳞状细胞癌细胞凋亡和NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响*

田 芳,江亚南，张晓艳，范天黎

1)郑州大学基础医学院病理生理学教研室 郑州 450001 2)郑州大学基础医学院药理学教研室 郑州 450001

食管癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其病死率居整个恶性肿瘤的第6位[1]。食管鳞状细胞癌(食管鳞癌)是一种侵袭性很强的肿瘤，预后差，临床进展迅速，多伴有淋巴结转移，且易复发。核因子-κB(nuclear factor-kappa B, NF-κB)是近年来发现的转录调控因子，是由p50和p65组成的异源二聚体。在绝大多数静止期的细胞中，NF-κB与其阻抑物IκBα蛋白相结合，以非活性形式存在于细胞质中。许多刺激物可以通过对IκBα的磷酸化而使其降解，使解离的NF-κB进入到核内并暴露核识别位点，从而促进靶基因的转录。研究[2-4]表明，在许多人类肿瘤(如肝癌、肠癌、食管鳞癌)中，NF-κB信号通路的激活在肿瘤的发生发展中起着重要的作用。辣椒素是红辣椒中的一种活性成分，具有抗病毒、 抗肿瘤和镇痛消炎作用，还可作为健胃剂，有促进食欲、改善消化等生物学功能。最近有研究[5]表明，辣椒素可以抑制肿瘤细胞的增殖、促进凋亡，因此可以作为一种药物或传统化疗药物的辅助用药，用于肿瘤治疗。作者应用Western blot及凝胶滞留实验检测辣椒素对食管鳞癌EC9706和Eca109细胞NF-κB信号通路相关蛋白表达和细胞凋亡的影响，探讨辣椒素是否能够通过阻断NF-κB信号通路，对食管鳞癌细胞的凋亡产生影响。

1 材料与方法

1.1主要试剂和细胞主要试剂：抗人p65、磷酸化IκBα(pIκBα)、Bcl-2单克隆抗体和兔抗人p50、IκBα多克隆抗体均购自美国Santa Cruz 公司，细胞核和细胞质蛋白提取试剂盒、生物素3’末端标记试剂盒、化学发光EMSA试剂盒购自Pierce公司，Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒购自美国Eckman coulterTM公司。RPMI 1640 培养液购自美国Gibco公司，辣椒素购自美国Sigma公司，氟尿嘧啶(5-FU)购自上海旭东海普药业公司。EC9706细胞由中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室惠赠，Eca109细胞由郑州大学基础医学院病理生理学教研室保存，细胞在RPMI 1640培养液(含体积分数10%的胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素)中，于37 ℃、体积分数为5% CO2的条件下培养，取对数生长期的细胞用于实验。

1.2辣椒素的配制将辣椒素溶解在乙醇中，配成300 μmol/L的溶液，置于-20 ℃冰箱保存。临用时，以完全培养液稀释辣椒素到所需浓度。对照组培养液为含体积分数10%小牛血清的RPMI 1640培养液。

1.3Westernblot法检测p65、p50、IκBα、pIκBα和Bcl-2蛋白的表达分别提取2种细胞的胞质和胞核蛋白各50 μg，Western blot法检测p65、p50、IκBα和pIκBα蛋白的表达。将2种细胞分别用0、50、100、200 μmol/L辣椒素作用24 h后，收集细胞，测定pIκBα蛋白的表达；同时提取总蛋白来检测Bcl-2蛋白的表达。使用120 g/L的SDS-PAGE胶，将分离蛋白转移到硝酸纤维膜上，于50 g/L脱脂奶粉溶液中作用2 h后，加入一抗(按照1100稀释)，4 ℃孵育过夜，TBST溶液洗涤3次，10 min/次，将膜放到标记有辣根过氧化物酶的二抗(按照150 000稀释)中，室温下孵育1 h，TBST洗涤3次，10 min/次，DAB显色。

1.4NF-κB与DNA结合活性的检测采用凝胶滞留实验。将细胞分别用0、100、200 μmol/L辣椒素作用24 h后，收集细胞，提取细胞核蛋白。生物素标记的NF-κB探针序列：上游5’-AGTTGAGGG GACTTTCCCAGGC-3’,下游3’-TCAACTCCCCTGAA AGGGTCCG-5’。将探针与10 μg细胞核提取物在20 μL的缓冲液中充分结合，在60 g/L的非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳后，将其转移到带正电荷的尼龙膜上，紫外灯下交联5 min，使用化学发光的方法，通过X线曝光，进行显影和定影。

1.5细胞凋亡的检测将2种食管鳞癌细胞分别分为对照组、辣椒素组(加入辣椒素作用48 h)、5-FU组(加入5-FU作用48 h)和联合组(同时加入辣椒素和5-FU作用48 h)，每组设3个复孔。收集4组细胞，制备单细胞悬液，计数2×106个细胞，转移进离心管离心，弃上清，使用预冷的PBS洗2次。加2.5 μL PI和5 μL Annexin V-FITC到100 μL的细胞悬液中，混匀后，使用对照细胞调零，分别以PI和Annexin V-FITC单染管作为基准参照，流式细胞仪检测，使用CellQuest 3.0软件对数据进行分析，计算凋亡细胞百分比。

1.6统计学处理采用SPSS 13.0进行分析， 采用2×2析因设计的方差分析比较4组凋亡细胞百分比的差异，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1EC9706和Eca109细胞中NF-κB信号通路的激活情况

2.1.1 蛋白检测结果 EC9706和Eca109的细胞质中IκBα蛋白为强表达，而pIκBα蛋白的表达稍弱(图1)。2种细胞的胞核中均存在p50和p65蛋白(图2)。

2.1.2 凝胶滞留实验结果 在2种食管鳞癌细胞的胞核中，NF-κB与 DNA的结合活性较高(图3)。

图1 2种细胞胞质中IκBα和pIκBα蛋白的表达

图2 2种细胞胞核中p50和p65蛋白的表达

图3 NF-κB与DNA的结合活性

2.2辣椒素对2种食管鳞癌细胞pIκBα和Bcl-2蛋白表达的影响2种细胞中pIκBα和Bcl-2蛋白的表达均随着辣椒素作用浓度的增加逐渐下降(图4)；NF-κB与DNA的结合活性随着辣椒素作用浓度的增加逐渐下降(图5)。

图4 辣椒素对EC9706(上)和Eca109(下)细胞pIκBα和Bcl-2蛋白表达的影响

图5 辣椒素对EC9706(左)和Eca109(右)细胞NF-κB与DNA结合活性的影响

2.3辣椒素对食管鳞癌细胞凋亡的影响见表1、2。

表1 辣椒素对EC9706细胞凋亡的影响(n=3)

F辣椒素=2 535.497，F5-FU=4 141.322，F交互=113.034，P均<0.001。

表2 辣椒素对Eca109细胞凋亡的影响(n=3)

F辣椒素=5 984.040，F5-FU=8 316.346，F交互=5.150，P均<0.05。

3 讨论

研究[5]认为食物中的化学成分可以特异性影响信号通路中的特定分子，从而预防癌症的发生。肿瘤化学预防是指利用天然的或合成的化学物质来阻止、减缓或者逆转癌症发生发展过程或者复发的策略。研究[6-7]发现辣椒素可以通过不同的机制发挥抗炎抗肿瘤作用。

该实验结果表明，在食管鳞癌细胞核中存在有NF-κB异源二聚体p50和p65的表达，且进入到核内的亚单位p50和p65能够与DNA结合并促进转录。NF-κB的半衰期较短，因此维持其活性就需要持续的外界刺激及蛋白合成。该实验结果还发现，IκBα及pIκBα蛋白在食管鳞癌细胞中有表达，pIκBα的表达尽管比较弱，但足以引起IκBα的降解，刺激NF-κB的活化。上述结果显示，在维持活化的NF-κB信号通路中IκBα在转录水平上的高表达及其磷酸化，起着重要的作用。

该实验结果显示，随着辣椒素浓度的增加，食管鳞癌细胞中pIκBα蛋白的表达逐渐下降，NF-κB与DNA的结合活性也逐渐下降。pIκBα表达水平的降低，会使NF-κB与IκBα蛋白相结合，以非活性形式存在于细胞质中，从而抑制NF-κB信号通路的活化；辣椒素通过抑制食管鳞癌细胞中IκBα的磷酸化，使p50和p65组成的异源二聚体不能从NF-κB-IκBα上解离，从而抑制了NF-κB与DNA的结合活性。

Maity等[8]的研究表明，辣椒素可以通过抑制蛋白酶的功能，激活凋亡信号通路，从而诱导细胞凋亡。该研究表明，在辣椒素作用下，食管鳞癌细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2的表达下降；流式细胞仪检测的结果显示，食管鳞癌细胞凋亡增加；当辣椒素与5-FU合用时，可显著增加食管鳞癌细胞对化疗药物5-FU的敏感性，凋亡的细胞也增加。该研究结果提示，辣椒素促进食管鳞癌细胞对5-FU敏感性的机制，或许是通过阻断NF-κB信号通路的活性，下调其调控的下游靶基因，从而对食管鳞癌细胞的增殖、抗凋亡产生影响。

综上所述，辣椒素可能通过下调NF-κB信号通路的活性，促进食管鳞癌细胞凋亡，增加对5-FU的敏感性。辣椒素有望成为食管鳞癌化学预防中的辅助用药。

[1] Guo K, Kang NX, Li Y, et al. Regulation of HSP27 on NF-kappaB pathway activation may be involved in metastatic hepatocellular carcinoma cells apoptosis[J].BMC Cancer， 2009， 9:100

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[5] 田芳, 宋敏, 许培荣, 等.姜黄素阻断NF-κB信号通路促进食管鳞癌细胞凋亡的体外研究[J].癌症,2008，27(6)：566

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[8] Maity R, Sharma J, Jana NR. Capsaicin induces apoptosis through ubiquitin-proteasome system dysfunction[J]. J Cell Biochem, 2010， 109(5): 933