流式细胞仪及其临床应用

2013-11-19刘波

中国医疗设备 2013年7期

刘波

宜昌市第二人民医院，设备科湖北宜昌 443000

LIU Bo

Department of Equipment, The Second Hospital of Yichang, Yichang Hubei 443000, China

作为应用流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）进行检测的技术平台，现代流式细胞仪产生于20世纪60～70年代。经过近40年的发展和完善，今天的流式细胞仪已经十分成熟，并被广泛的运用于从基础研究到临床实践的各个方面，涵盖了细胞生物学、免疫学、血液学、肿瘤学、药理学、遗传学及临床检验等领域，在各学科中发挥着重要的作用。随着现代科技的高速发展，为了满足生命科学对细胞分析更高层次的要求，流式细胞技术已经在检测技术、分选技术及高通量分析等方面取得了许多突破。流式细胞仪是以激光为光源，集流体力学技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。

1 流式细胞仪的工作原理[1-4]和基本结构

1.1 流式细胞仪的工作原理

流式细胞仪用于检测单细胞或微粒的信号，一般是将待测细胞或微粒进行荧光染色后制成悬液标本，在一定气体压力下将待测样品压入流动室，不含细胞或微粒的缓冲液（又称鞘液）在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测细胞或微粒流成一定角度，使鞘液包绕着细胞或微粒高速流动，形成一个圆形的流束（即鞘流），待测细胞在鞘液的包裹下单行排列，依次通过流式细胞仪的检测区域。激发光源经过聚焦整形后的光束垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下产生激发荧光，同时产生散射光。这两种光信号被在90°方向的光电倍增管荧光检测器和前向角光电二极管散射光检测器接收，经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过A/D转换器，将转换来的电信号转换为数字信号输送给计算机。计算机将各种数字信号进行计算处理后，得到相应的细胞大小、活性、细胞内细胞因子、DNA含量和细胞周期、核糖核酸（Ribonucleic Acid，RNA）含量、酶和抗原的性质等参数。

细胞的分选是通过分离含有单细胞的液滴而实现的。在流动室的喷口上配有一个频率为30 kHz的压电晶体，充电后振动，使啧出的液流断裂为一连串均匀的液滴，待测细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴充以正、负不同的电荷，当液滴流经带有几千伏的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，不予充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。

1.2 流式细胞仪的基本结构[5-11]

以库尔特FC50和BD公司的LDR流式细胞仪为例，流式细胞仪的基本结构可以分为液流系统、光学检测系统以及数据转换处理系统三部分。

1.2.1 液流系统

液流系统是流式细胞仪的核心部件。流动室由石英玻璃制成，并在石英玻璃中央开一个微孔，供细胞单个流过，检测区在该孔的中心，流动室内充满了鞘液,鞘液的作用是将样品流环包。样品流在鞘流的环包下聚焦，保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而得到准确的细胞荧光信息。液流驱动系统由空气泵、压力调节、压力传感器等组成。空气泵产生压缩空气，通过鞘流压力调节器加在鞘液上一恒定的压力，这样鞘液可匀速流过流动室。

鞘流原理：根据流体力学理论，流动的液体分为稳流和湍流两种状态。1883年雷诺发现了液体流动状态的分界点，即雷诺系数，其定义为：在一个直径为d的管子内，液体的流速为v，密度为ρ，黏滞系数为n，Re = dρv/n。当Re＞2300 时，液流处于稳流状态；当Re＜2300时，液流处于湍流状态。

在流式细胞仪中，希望标本处于稳流状态。如果标本流的直径固定为100μm，根据水密度和黏粘滞系数带入公式可计算出v=23 m/s，这就是保持标本流稳定的最高速度，考虑到标本流和管壁之间的浸润情况，常把流速限制在10 m/s以下。

为了稳定标本流的直径，流动室在设计时还利用了液流的聚焦作用。根据流体力学的伯努利定律， S1V1=S2V2，S和V分别为两个管道的截面积和液体流速。在流动室中，S1>S2，则V2>V1。当两个截面积突然发生变化时，液流从截面积大的部分流入截面积小的部分后，并非全部形成于管壁的稳流，而是在入口处有一段收缩的区域，这种现象称为液流聚焦，见图1。在细胞仪中常把激光激发点设在此处。由于标本流变小，通常为10～20μm，可避免多个细胞重叠进入检测区，只需要简单的改变标本的浓度，就可以设置细胞流经激发点的平均距离，使其间隔达数百μm，从而实现对单个细胞的测量。

图1 液流聚焦示意图

1.2.2 光学检测系统

现代流式细胞仪的激发光源通常采用激光，由于激光焦点处能量分布为正态分布，中心处能量最高。因此，当样本速率选择高速时，处在样本流不同位置的细胞或颗粒，受激光照射的能量不一样，从而被激发出的荧光强度也不相同。流式细胞仪光路布局为多个波长的激光器通过棱镜组聚集成一束光束，在通过消色差透镜聚焦到流动室上，对标本液流进行照射。标本被激光照射后产生前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）及侧向荧光（SFL）。在流式细胞分析中，需要针对细胞的荧光特性进行分析，所以采用前向散射光和侧向荧光对细胞进行分析。

前向散射光（FSC）主要为了获取细胞体积大小的数据，散射光经过透镜、狭缝、滤光片后被光电接收二极管采集，送往后续电路处理分析。侧向荧光（SFL）主要是分析细胞的荧光特性，根据荧光探针的机理，细胞被荧光染料着色后，在相应波长的激光照射下，激发荧光，在该波长下显现出该细胞特有的荧光特性，从而进行准确计数和分析。侧向散射光（SSC）则对细胞的内容物核质比等信息进行分析，作为流式细胞分析的辅助手段，该项技术在血细胞分析仪中成为筛选分析细胞类型的手段。侧向荧光（SFL）经过透镜和不同波长的分光器，分送到各个光电倍增管（PMT）中进行信号接收，并送往后续电路进行分析。侧向散射光（SSC）一般经过分光后直接交给光电二极管进行接收分析。

1.2.3 数据转换处理系统

（1）电子系统。流式细胞仪的电子系统主要由光电转换器件光电二极管、PMT和信号处理电路组成。PMT可将光子转换为电子，当一个光子到达PMT的光电阴极时，可产生数十万的电子。流式细胞仪中所用PMT的电流放大倍数可达106，但是从统计学角度来说，为了保证检测的灵敏度和精密度，最好能从整体中抽取更多的样本进行分析，测定结果才会更准确地反映整体的真实情况，精密度会更好。光电转换器件可将光信号转换为电流信号，但传统的模拟电路更适合处理电压信号而不是电流信号，需要由前置放大电路进行处理。前置放大电路是流式细胞仪信号处理电路中的第一个环节，它将电流信号转换为电压信号，同时可调整直流背景噪音为零，也就是说，在没有光信号进入时所输出的电压值为零。前置放大器的性能(增益、信噪比)是决定整个流式细胞仪电子系统输出信号质量的关键部分。前置放大电路所输出的电压信号为脉冲信号，脉冲高度与入射光信号的强度成正比，其峰值为被测细胞通过光束中心位置时所产生的最强信号。为了记录这一峰值信号，在前置放大电路之后使用了峰值检测器，峰值检测器可在信号脉冲消失之后保持峰值信号，直到模/数转换电路将模拟的峰值信号转换为数字信号之后才重新复位，记录下一个信号。

（2）计算机系统。计算机系统用于控制整个仪器的运行和数据采集、数据分析。操作平台上BD流式细胞仪应用了苹果系统而贝克曼库尔特流式细胞仪大多为WINDOWS界面,方便用户对数据和图片的处理、打印报告单及论文资料的整理发表、硬件升级以及网络化管理等，同时它用于对仪器的硬件部分进行控制，实现数据的采集和对数据的分析。

流式细胞仪的数据格式为FCS2.0，是国际分析细胞学学会ISAC修改确定的。

数据分析模式为列表模式（List Mode）和直方图模式（Histogram Mode），前者将每个细胞各个检测参量一次排列存储。如1个细胞被激光照射后，会产生多个数据：前向散射光、侧向散射光、数个荧光信号，这些数据被列表保存。优点是可对原数据进行再处理和分析，缺点是文件体积较大，不够直观。后者只能记录每个样本检测结果的图形数据，可以显示和打印文件，文件体积小，但不能对原始数据进行再次分析。

流式细胞分析的设门，是伴随数据的图形化分析而产生的，指在细胞分布图中指定一个范围或一片区域，对其中的细胞进行单参数或多参数分析。门的形状包括线性门、矩形门、圆形门、多边形门、任意形状门、四象限门。反向设门用于FSC/SCC散点图中细胞群间相互重叠的情况。

2 流式细胞仪的临床应用

流式细胞仪目前被广泛应用于细胞生物学、植物学、分子生物学、生物化学、微生物学等理论科学的研究和临床医学的疾病诊断、治疗和监测等医疗实践中[12-14]。

2.1 流式细胞仪在免疫学中的应用

利用多参数FCM，对淋巴细胞比例、淋巴细胞中T、B、NK细胞的比例及T细胞亚群及细胞表型进行分析[15]。

2.2 细胞周期测定和DNA倍体分析[16-17]

细胞增殖周期分为G0、G1、S、G2、M期。S期是DNA合成期，在S期内，DNA进行复制，使细胞的DNA含量由2倍体(46条染色体)变为4倍体。G1和G2期为DNA合成前、后期，这两个时期无DNA的合成，但RNA和蛋白质进行合成。M期为有丝分裂期，在此期一个细胞分裂为2个细胞。细胞内的92条染色体分裂成2组46条染色体，使每个细胞内具有46条染色体。在M期分裂成2个子细胞之前，G2和M期细胞的DNA含量均为恒定的4C。M期以后部分细胞进入G1期，继续进行增殖，部分细胞进入G0期，即静止期，不再继续增殖。

利用DNA的荧光染料碘化丙啶（Propidium Iodide，PI），与细胞内的DNA结合，可反映细胞内DNA含量，用DNA直方图显示。FCM分析一个群体细胞峰DNA倍体与细胞周期，将DNA含量直方图分为3部分，即G0/G1,S,G2/M期3个细胞峰。G0/G1和G2/M细胞峰DNA的含量成正态分布，S期细胞峰则是一个加宽的正态分布，具有2倍体DNA含量细胞为G0/G1期细胞，4倍体DNA含量细胞为G2/M期细胞，DNA含量介于两者之间的细胞为S期细胞。

DNA倍体用DNA指数（DIVA Index, DI）表示，DNA指数是指测量样本G0/G1期DNA含量与正常人淋巴细胞G0/G1期DNA含量的比值。正常细胞DNA指数为1.00，DNA指数> 1，为超2倍体，< 1为亚2倍体，两者可统称为非整倍体。非整倍体细胞中肿瘤的特异性标志，是癌前病变发生癌变的一个重要指标。

2.3 流式细胞仪在血液系统疾病检测中的应用

FCM通过对外周血细胞或骨髓细胞表面抗原和DNA的检测分析，对各种血液病的诊断、预后判断和治疗起着举足轻重的作用[18-20]。

（1）白血病的诊断和治疗。FCM采用各种抗血细胞表面分化抗原(cD)的单克隆抗体，借助于各种荧光染料测定一个细胞的多种参数，以正确地判断出该细胞的属性。各种血细胞系统都具有其独特的抗原，当形态学检查难以区别时，免疫表型参数对各种急性白血病的分型诊断和鉴别诊断有决定性作用。同其他肿瘤的治疗一样，测定DNA倍体和进行细胞周期分析对指导白血病化疗有一定作用，不同的白血病患者或同一患者在不同病期白血病细胞增殖状况不同，定期了解细胞增殖情况采取相应药物可以提高疗效。FCM通过对人白细胞抗原(HIA)配型的测定可以为异体干细胞移植病人选择出最合适的供体。FCM测定CD34HLA—DR、CD33等细胞表面标记物，是干细胞移植术重要的监测手段。用FCM检测一系列指标观察病人的恢复状态，可以对预后做出早期的判断。

（2）其他种类血液病的诊断和治疗监测。阵发性睡眠性血红蛋白尿症是一种造血干细胞克隆病，细胞CD44、CD59抗原表达减低是该病的一个特点。该抗原属于血细胞表面磷脂酰肌醇锚连蛋白家族，是重要的补体调节蛋白，它通过与补体C8、C9的结合以阻止补体膜攻击复合物的形成，从而抑制细胞被补体系统溶解。FCM采用荧光标记的单克隆抗体对血细胞CD59的表达做定量分析，可以协助临床做出诊断并判断疾病的严重程度。

（3）网织红细胞的测定及临床应用。目前，FCM检测网织红细胞主要用于预测骨髓移植的效果解释各种红细胞增长低下性贫血的发病原因，评价某些新的重组生物制剂的治疗效果。

2.4 流式细胞仪在血栓与血小板相关疾病中的应用

血小板活化时其质膜糖蛋白较其静止期发生显著改变，FCM可以通过单抗免疫荧光标记监测血小板及活化情况。采用全血法测定，只需微量标本，在许多血小板相关疾病的诊断上有重要的临床应用价值。

（1）血栓性疾病。动脉粥样硬化前期血小板沉积，可导致心肌梗死和卒中(中风)，抗血小板药能降低心肌缺血的发生率，证明心肌缺血与血小板活化有关。全血法FCM检测表明心绞痛和心肌梗死患者循环系统中有活化的血小板.血小板活力也增强。冠状窦血液的检测表明，冠状血管成形术会导致血小板活化。如果血流恢复后有高水平的活化血小板，血管可能因为内皮细胞严重损伤或血小板栓塞而发生再狭窄。因此，活化血小板的检测能预测冠状血管成形术后发生急性缺血事件的危险性。

（2）血小板缺陷性疾病。血小板缺陷性疾病如巨大血小板综合征，它是由于GPlb—IX复合物先天缺陷所致的血小板形态巨大，功能异常的出血性疾病。巨大血小板从全血中分离很困难。FCM检测能特异性地识别血小板，省去了分离巨大血小板的步骤，使检测更简便、精确。

（3）血小板减少性疾病。破坏过多或生成减少均能导致血小板减少。血小板相关抗体(PAIg)是反映血小板的破坏的指标，虽然其临床意义仍有争议。流式细胞仪用较少血量(1ml)的血液制备的血小板就能测定血小板上的PAIg平均水平。FCM还能测定其它一些反映血小板破坏的指标，如PAIgG、PAIgM、C3等。同时FCM能像检测网织红细胞那样，检测到循环中的“网织”血小板，来判断血小板的生成。

2.5 流式细胞仪在肿瘤学中的应用

FCM已成为肿瘤学的主要研究手段之一，近年来已应用DNA倍体测定技术对多种实体瘤细胞进行研究。DNA含量直接代表细胞的倍体状态，非倍体细胞与肿瘤恶性程度有关。

（1）发现癌前病变，协助肿瘤早期诊断。人体正常的体细胞均具有比较稳定的DNA二倍体含量。当人体发生癌变或具有恶性潜能的癌前病变时，细胞DNA含量可发生异常改变，DNA非整倍体出现率增高。FCM可精确定量DNA含量的改变。作为诊断癌前病变发展至癌变中的一个有价值的标志，FCM能对癌前病变的性质及发展趋势作出估价，有助于癌变的早期诊断。

（2）肿瘤的诊断、预后判断和治疗中的作用。DNA非整倍体细胞峰的存在可为肿瘤诊断提供有力的依据。肿瘤细胞DNA倍体分析对病人预后的判断有重要作用，异倍体肿瘤恶性病变的复发率高、转移率高、死亡率也高，而二倍体及近二倍体肿瘤的预后则较好。FCM还可根据化疗过程中肿瘤DNA分布直方图的变化了解细胞周期细胞动力学变化，评估疗效。