运动提高糖尿病大鼠骨骼肌GLUT4基因表达的信号机制

张红学

（郑州大学 体育学院，河南 郑州 450044）

大量研究表明运动可以提高骨骼肌葡萄糖运载体4(glucose transporter 4，GLUT4)的表达[1-3]，这对治疗以胰岛素抵抗为主要病因的糖尿病有重要作用[4-5]，但机制尚不清楚。凝胶迁移(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)实验，显示了GLUT4启动子区域存在肌细胞增强因子2(myocyte enhancer factor 2，MEF2)的结合位点[6]。Thai等[7]的研究进一步发现，糖尿病大鼠骨骼肌MEF2和GLUT4 结合活性及GLUT4mRNA表达量均显著低于正常大鼠，而用胰岛素刺激糖尿病大鼠骨骼肌细胞之后，发现 MEF2和 GLUT4 结合活性及GLUT4表达量均恢复到正常大鼠水平，提示了MEF2和GLUT4结合活性的变化是影响糖尿病大鼠GLUT4表达失常的重要环节[8]。虽然我们以往的研究结果也显示了运动通过提高骨骼肌MEF2和GLUT4结合活性而提高GLUT4基因表达[10]，但此机制未在糖尿病患者中得到证实。Mukwevho[9]的研究发现利用细胞钙离子调节子 Caffeine 孵育激活 C2C12肌细胞钙/钙调素依赖性蛋白激酶 II(calcium-calmodulin depen-dent protein kinase II，CAMKII)，可以引起肌细胞核内 MEF2和GLUT4结合活性显著增加，且这种增加伴随着GLUT4基因和蛋白的表达量的提高。运动能够激活CAMKII[11]，提示了运动可能通过激活CaMKII而提高糖尿病大鼠MEF2和GLUT4结合活性和GLUT4表达的增加。值得注意的是，离体研究结果并不一定能真实反映在体的真实状况。因此本实验通过KN93(CaMKⅡ的特异性抑制剂)抑制运动对糖尿病大鼠骨骼肌CAMK II的激活作用，研究在体运动情况下CAMK II对糖尿病大鼠MEF2和GLUT4结合活性和GLUT4表达的调节作用。

1 材料和方法

1.1 实验动物

本实验以100只12~14周龄，健康清洁级SD大鼠为研究对象，河南省实验动物中心提供。试验期间，室内温度保持在 20~25 ℃，相对湿度保持在50%~70%，每天光照12 h。正常饲养的1周时间内所有大鼠自由进食(普通饲料)和饮水。

1.2 糖尿病大鼠模型的建立

SD大鼠适应性喂养1周后，随即选出40只作为正常对照，继续以普通饲料饲养。其余60只拟建立糖尿病大鼠模型。方法如下[12]：以高质饲料(碳水化合物和脂肪各占41%，蛋白质占18%，均为质量比)饲养4周，并禁食 12 h(晚上)后，腹腔下注射链脲佐菌素(streptozotocin，STE)，注射质量分数为30 mg/kg(柠檬酸钠-柠檬酸盐缓冲液配置，pH＝4.2)，STE购于 Sigma公司。注射后继续给予高脂饲料，自由饮水。72 h后测定空腹血糖浓度(测血糖浓度之前禁食12 h)，凡血糖浓度大于6.7 mmol/L者视为造模成功，成功共35只。

1.3 运动方案和取材

实验安排在第6周进行，实验前1 d进行1~2次适应性跑台练习，并于当天晚上 24：00禁食(耐力训练组不禁食)。实验当天根据体重正常对照大鼠和糖尿病组大鼠各自随机分为5组：安静对照(control，C)、一次性运动组、一次性运动+KN93组、耐力训练组、耐力训练+KN93组。正常对照大鼠每组8只，糖尿病大鼠每组7只。

安静对照组和一次性运动组大鼠，分别于取材前和运动前0.5 h腹腔注射生理盐水。一次性运动+KN93组大鼠运动前0.5 h腹腔注射KN93。注射质量分数为5 mg/kg，KN93购于Sigma公司。一次性运动组大鼠采用坡度为10°的跑台运动，跑台速度为20 m/min(根据Armstrong[13]的公式y=1.25x+47.7(y为VO2max百分比；x为跑台速度)，本研究采用的相对强度是 72%VO2max强度)，运动时间1 h。耐力训练组大鼠采用同样的跑台运动方式，每天1 h，持续1周。根据预实验结果一次性运动组大鼠运动后3 h取材，耐力训练组大鼠最后一次训练后12 h取材，乙醚麻醉后取右侧股四头肌，迅速投入液氮，再转移至－80 ℃冰箱保存。

1.4 指标测定方法

1)CaMK II磷酸化水平。

取大鼠股四头肌100 mg，液氮研磨，移入离心管并加入1 mL蛋白裂解液，冰上静置30 min，4 ℃ 12 000 r/min离心1 h，取上清。蛋白含量采用pierce公司的BCA蛋白定量试剂盒测定。聚丙烯酰胺凝胶电泳分离目标蛋白(P-CaMKII和β-actin)，再将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉封闭。一抗(P-CaMKII，β-actin) 4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育1 h。曝光前加入发光液，暗处反应1 min，暗室压片曝光。生物电泳图像分析软件拍照，Image J软件读取蛋白的积分灰度值，结果以积分灰度值的比值表示。

2)GLUT4 mRNA表达。

大鼠股四头肌100 mg，液氮研磨后，1 mL Trizol冰上静置10 min，0.2 mL氯仿冰上静置5 min，4 ℃12 000 r/min离心15 min，取上清，等体积异丙醇室温静置10 min，4 ℃ 12 000 r/min离心15 min，弃上清，1 mL体积分数为75%酒精，4 ℃ 7 500 r/min离心10 min，弃上清，10 μL EDPC水溶解mRNA。逆转录的反应条件：75 ℃ 5 min，42 ℃ 1 h，70 ℃ 15 min。实时定量部分采用ABI公司荧光染料反应混合体系试剂盒。加入目的基因的 cDNA模板后，再分别加入GLUT4的引物和β-actin的引物，进行实时定量。所需引物由上海生工合成。实时定量数据由ABI实时定量7500 PCR仪测得，数据由仪器自带分析软件分析完成。mRNA表达结果以比较CT法相对定量[14]。

3)MEF2和GLUT4结合活性。

EMSA法测定MEF2和GLUT4结合活性。Pierce核蛋白提取试剂盒提取核蛋白，Pierce蛋白定量试剂盒测定蛋白含量。聚丙烯酰胺凝胶预电泳20 min后，配置10 μL上样体系(4 μL三蒸水、2 μL细胞核蛋白、2 μL标记探针、2 μL 5X EMSA/Gel-Shift上样缓冲液)。加入标记探针后，混匀，室温放置20 min，再加入2 μL EMSA/Gel-Shift上样缓冲液，混匀后立即上样。电泳电压按照10 V/cm设置。电泳至上样缓冲液中的蓝色染料溴酚蓝至胶下1/4处。Western所使用的电转膜装置，0.5XTBE为转膜液，把胶上的探针或蛋白以及探针和蛋白的复合物转移到尼龙膜上。紫外交联仪254 nm紫外波长交联45~60 s。封闭液封闭15 min，加入一定量抗生物素蛋白链菌素+辣根过氧化物酶复合物，摇床上摇动15 min，并洗涤4次后，暗室曝光。生物电泳图像分析软件拍照，ImageJ软件读取蛋白的积分灰度值。结果以积分灰度值的比值表示。

1.5 数据统计

统计分析使用SPSS 13.0统计学分析软件完成。所有数据均以平均数±标准差表示。同一指标之间比较采用单因素方差分析。显著性水平为P<0.05。

2 试验结果及分析

2.1 CaMK II磷酸化水平

由图1、图2看出，正常对照及糖尿病大鼠一次性运动组，CaMK II磷酸化水平与安静对照组相比分别升高了96%和140%(P<0.05)。正常对照及糖尿病大鼠一次运动+KN93组，CaMK II磷酸化水平与一次性运动组相比分别降低了 37%和 48%(P<0.05)，且与安静对照组相比差异均没有显著性(P>0.05)。

图1 P-CaMKII蛋白表达图谱

图2 CaMK II磷酸化水平

2.2 GLUT4基因表达量

由图3看出，正常对照大鼠一次性运动组及耐力训练组，骨骼肌GLUT4基因表达量与安静对照组相比分别升高了54%和172%(P<0.05)。一次运动+KN93组，骨骼肌 GLUT4基因表达量与一次性运动组相比降低了27%(P<0.05)，耐力训练+KN93组，骨骼肌GLUT4基因表达量与耐力训练组相比没有显著差异(P>0.05)。糖尿病大鼠一次性运动组，骨骼肌GLUT4基因表达量与安静对照组相比没有显著差异(P>0.05)，耐力训练组，骨骼肌GLUT4基因表达量与正常对照大鼠耐力训练组相比低了36%(P<0.05)，但与安静对照组相比升高了145%(P<0.05)。耐力训练+KN93组，骨骼肌GLUT4基因表达量与耐力训练组相比降低了29%(P<0.05)，但与安静对照组相比仍升高了74%(P<0.05)。

图3 GLUT4基因表达量(相对值)

2.3 MEF2-GLUT4结合活性

由图4看出，正常对照大鼠一次性运动组及耐力训练组，骨骼肌MEF2和GLUT4结合活性与安静对照组相比分别升高了 113%和 244%(P<0.05)。一次运动+KN93组，骨骼肌MEF2和GLUT4结合活性与一次性运动组相比降低了42%(P<0.05)，耐力训练+KN93组，骨骼肌MEF2和GLUT4结合活性与耐力训练组相比没有显著差异(P>0.05)。糖尿病大鼠一次性运动组，骨骼肌MEF2和GLUT4结合活性与安静对照组相比没有显著差异(P>0.05)，耐力训练组，骨骼肌MEF2和GLUT4结合活性与安静对照组相比升高了157%(P<0.05)。耐力训练+KN93组，骨骼肌MEF2和GLUT4结合活性与耐力训练组相比降低了51%(P<0.05)，且与安静对照组相比没有显著差异(P>0.05)。

图4 MEF2和GLUT4结合活性(相对值)

3 讨论

GLUT4作为骨骼肌中葡萄糖跨膜转运的重要转运蛋白，研究显示它的表达量失常是胰岛素抵抗的重要原因。而对于糖尿病患者来说，胰岛素抵抗是其中的重要环节[15-16]。运动可以提高GLUT4基因和蛋白的表达，那么运动对胰岛素抵抗的糖尿病患者骨骼肌GLUT4含量会产生什么影响呢。本实验发现糖尿病大鼠1 h跑台运动后，其骨骼肌GLUT4基因表达量并没有显著升高，而1周耐力训练之后，其骨骼肌GLUT4基因表达量虽然显著低于正常对照大鼠耐力训练组，但与糖尿病大鼠安静对照组相比已经显著升高，提示了虽然单纯的一次性运动可能并不能改善糖尿病大鼠骨骼肌GLUT4表达的缺陷，但经过一定时期的训练完全可以起到改善糖尿病大鼠GLUT4基因表达的作用，这对预防和治疗胰岛素抵抗有重要作用[17-18]，但机制尚不清楚。

MEF2是最早在骨骼肌管核发现的一种能识别基因启动子、增强子或特定序列而调控基因表达的蛋白质。近年来大量离体和在体的研究均显示转录因子MEF2和GLUT4启动子区域MEF2结合位点结合，为GLUT4蛋白转录所必须[6-7]。虽然利用了两种不同的蛋白质和DNA结合活性测试方法，Smith等[8，19]的研究均显示了运动后MEF2和GLUT4结合活性显著提高。提示了运动通过提高MEF2和GLUT4的结合活性而提高骨骼肌GLUT4的表达。对于糖尿病大鼠来说，本实验发现一周耐力训练之后，其骨骼肌GLUT4表达提高的同时同样伴随着骨骼肌细胞核内MEF2和GLUT4结合活性的显著提高，提示了运动同样通过提高糖尿病大鼠骨骼肌 MEF2和 GLUT4结合活性而提高骨骼肌GLUT4的表达。而试验中糖尿病大鼠1次性跑台运动后，MEF2和GLUT4结合活性及GLUT4mRNA表达量均与安静对照组无显著性差异，可能为此推测提供了进一步的证据。

CAMK是一类广泛分布的丝/苏氨酸蛋白激酶家族，研究显示CAMKⅡ活性与THR286 位点的磷酸化水平呈高度正相关[20]。本实验中大鼠一次性跑台运动后，骨骼肌 CaMKⅡTHR286位点磷酸化水平显著升高，与以往研究的结果运动可以提高 CaMKⅡ活性相一致[20]。本试验中，运动+KN93组大鼠一次性跑台运动后，骨骼肌 CaMKⅡ活性显著低于跑台运动组，说明了 KN93抑制了运动对 CaMKⅡ的激活作用[21-22]。Smith等[8]的研究发现高表达具有稳定 CAMK II活性(constitutively active)的肌管细胞，其 MEF2和 GLUT4结合活性显著高于高表达显性CAMK II失活(dominant negative)的肌管细胞。Mukwevho等[9]的研究也发现，利用Caffeine 孵育激活C2C12肌管细胞CAMK II活性，可以引起肌细胞核内MEF2和GLUT4结合活性显著增加，而如果预先在培养基中加入CAMK II活性抑制剂KN93，这种变化消失，提示了CaMK II可能参与调节运动诱导的MEF2和GLUT4结合活性和GLUT4表达的增加。本实验中正常对照大鼠，1次性跑台运动+KN93其骨骼肌细胞核内MEF2和GLUT4的结合活性及骨骼肌GLUT4基因表达量均显著低于1次性跑台运动组，与实验假设及以往研究结果[8-9]相一致。

Zheng等[23]利用GLUT4氯霉素酰基转移酶报告基因转染小鼠骨骼肌细胞，发现转染包含位于 GLUT4启动子区域MEF2结合位点序列，并利用腺苷酸活化的蛋白激酶(5’-AMP activated protein kinase，AMPK)的药理激活剂AICAR(5’-aminoimidazole-4carboxamide-riboside)刺激小鼠骨骼肌细胞后，发现GLUT4氯霉素酰基转移酶报告基因活性显著增加。进一步的 EMSA实验也发现AICAR刺激组小鼠骨骼肌细胞核内MEF2和GLUT4结合活性也显著高于生理盐水组[23-24]。由于AICAR并不是AMPK的特异性激活剂[25]，我们以往的研究利用转基因技术制造出 AMPK高表达转基因小鼠，发现由于AMPKα2的高表达，1 h跑台运动后，AMPKα2高表达转基因鼠骨骼肌细胞核内 MEF2和GLUT4结合活性及GLUT4基因表达量，均比野生鼠增加更为显著[19]。据此我们推测，CAMK II和AMPK可能均参与调节了运动后MEF2和GLUT4结合活性及GLUT4基因表达的增多，当其中一个通路长期受到抑制时，另外一个通路可能被激活从而代偿了受抑制通路对MEF2和GLUT4结合活性及GLUT4基因表达的调节作用。我们以往的实验结果AMPKα2基因敲除小鼠4周耐力后，骨骼肌MEF2和GLUT4结合活性及GLUT4基因表达量与野生鼠差异均没有显著性[19]；本实验中耐力训练+KN93组大鼠，其骨骼肌细胞核内 MEF2和GLUT4的结合活性及骨骼肌GLUT4基因表达量与耐力训练组均没有显著差异，可能为此推测提供了进一步的证据。

对于糖尿病大鼠来说，实验发现耐力训练+KN93组糖尿病大鼠骨骼肌细胞核内MEF2和GLUT4的结合活性显著低于耐力训练组，提示了运动同样通过激活糖尿病大鼠骨骼肌CAMK II而提高其骨骼肌细胞核内MEF2和GLUT4的结合活性。而值得注意的是虽然耐力训练+KN93组糖尿病大鼠骨骼肌细胞核内MEF2和GLUT4的结合活性与安静对照组相比没有显著差异，但其骨骼肌 GLUT4基因表达量与安静对照组相比却显著升高，提示了对于糖尿病大鼠来说，MEF2和GLUT4的结合活性并不是影响其GLUT4表达的唯一因素，与正常大鼠实验结果不一致。Thai[7]的研究也发现，敲除GLUT4启动子区域上MEF2结合位点序列，虽然GLUT4mRNA表达会有所减低，但仍高于糖尿病大鼠mRNA表达水平，提示了GLUT4启动子区域还存在着未知的转录因子结合位点，未知的转录因子与此位点结合而调节GLUT4基因的转录。通过DNA序列同源性分析，Oshel[26]的研究发现，位于GLUT4启动子区域，长度为60对（-712/-772）碱基片段，具有90%以上的同源性，推测此区域可能存在转录因子结合位点。通过进一步的 DNaseⅠ足迹实验分析发现，-742/-712碱基序列对应部位有蛋白质与之结合，Oshel把此段序列命名为Domain 1区域。利用GLUT4萤火素酶报告基因转染 C2C12肌细胞，发现转染Domain 1区域碱基片段时，荧光素酶活性显著增加，说明其片段对于 GLUT4的表达有着重要作用。随后Oshel利用酵母单杂交技术筛选到与Domain区域序列的结合蛋白，并根据此蛋白功能命名为GLUT4增强因子(GLUT4 enhance factor，GEF)。事实上，近年来GEF对GLUT4表达的调节作用研究不是很多，再加上本实验研究并没有测定骨骼肌细胞核内GEF和GLUT4的结合活性，所以我们只能推测GEF可能参与调节了训练引起糖尿病大鼠GLUT4基因表达的提高，并以此来解释耐力训练+KN93组大鼠骨骼肌细胞核内MEF2和GLUT4的结合活性与安静对照组相比没有显著差异，而其骨骼肌 GLUT4基因表达量与正常对照组却显著升高，具体机制有待进一步研究。

运动通过激活糖尿病大鼠骨骼肌CAMK II而提高其骨骼肌细胞核内MEF2和GLUT4的结合活性，虽然MEF2和GLUT4的结合活性参与调节了正常大鼠骨骼肌GLUT4基因表达，但并不是影响糖尿病大鼠骨骼肌GLUT4基因表达的唯一因素。

[1] Gulve E A，Spina R J. Effect of 7-10 days of cycle ergometer exercise on skeletal muscle GLUT4 protein content [J]. J Appl Physiol，1995，79：1562-1566.

[2] Kraniou Y，Cameron-Smith D，Misso M，et al.Effects of exercise on glut4 and glycogenin gene expression in human skeletal muscle[J]. J Appl Physiol，2000，88(2)：794-796.

[3] Kraniou G N，Carmeron-Smith D，Hargreaves M.Effect of short-term training on glut4 mRNA and protein expression in human skeletal muscle[J]. Exp Physiol，2004，89(5)：559-563.

[4] Ren J M，Marshall B A，Gulve E A，et al. Evidence from transgenic mice that glucose transport is rate-limiting for glycogen deposition and glycolysis in skeletal muscle[J]. J Biol Chem，1993，268(22)：16113-16115.

[5] Dohm G L. Invited review：Regulation of skeletal muscle GLUT4 expression by exercise[J]. J Appl Physiol，2002，93(2)：782-787.

[6] Liu M L，Olson A L，Edgington N P，et al. Myocyte enhancer factor-2 (Mef2) binding-site is essential for C2C12 myotube-specif i c expression of the rat Glut4 muscle-adipose facilitative glucose-transporter gene[J]. J Biol Chem，1994，269：28514-28521.

[7] Thai M V，Guruswamy S，Cao K T，et al. Myocyte enhancer factor 2 (MEF2)-binding site is required for GLUT4 gene expression in transgenic mice. Regulation of MEF2 DNA binding activity in insulin-def i cient diabetes [J]. J Biol Chem，1998，273：14285-14292.

[8] Smith J A，Collins M，Grobler L A，et al. Exercise and CaMK activation both increase the binding of MEF2A to the Glut4 promoter in skeletal muscle in vivo[J]. Am J Physiol Endocrinol Metab，2007，292：E413-E420.

[9] Mukwevho E，Kohn T A，Lang D，et al. Caffeine induces hyperacetylation of histones at the MEF2 site on the Glut4 promoter and increases MEF2A binding to the site via a CaMK-dependent mechanism [J]. Am J Physiol Endocrinol Metab，2008，294：E582-E588.

[10] 张红学. CaMK Ⅱ参与调解运动诱导的MEF2/GLUT4 DNA结合活性及GLUT4表达研究[J].北京体育大学学报，2011，34(9)：51-54.

[11] Rose A G，Hargreaves M. Exercise increases Ca2+-calmodulin-dependent protein kinase II activity in human skeletal muscle [J]. J Physiol，2003，553：303-309.

[12] Wu Y，Qu-Yang J P，Wu K，et al. Hypoglycemic effect of Astragalus polysaccharide and its effect on PTP1B[J]. Acta Pharmacologica Sinica，2005，26(3)：345-352.

[13] Armstrong R B，Laughlin M H，More L，et al.Metabolism of rats running up and down an incline[J]. J Apply Physiol，1983，55(2)：518-521.

[14] Livak K J，Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ddCT method[J]. Methods，2001，25：402-408.

[15] Zisma A，Peroni O D，Abel E D，et al. Targeted disruption of the glucose transporter 4 selectively in muscle causes insulin resistance and glucose intolerance[J]. Nat Med，2000，6(8)：924-928.

[16] Abel E D，Peroni O，Kim J K，et al. Adipose-selective targeting of the GLUT4 gene impairs insulin action in muscle and liver[J]. Nature，2001，409(6821)：672-673.

[17] Lecturque A，Loizeau M，Vaulont S，et al. Improvement of insulin action in diabetic transgenic mice selectively overepressing GLUT4 in skeletal muscle[J].Diabetes，1996，45(1)：23-27.

[18] Tsao T S，Burcelin R，Katz E B，et al. Enhanced insulin action due to targeted GLUT4 overexpression exclusively in muscle[J]. Diabetes，1996，45(1)：28-36.

[19] 龚豪杰，谢谨，张楠，等. 不同强度运动对AMPKα2三种不同基因状态鼠MEF2/GLUT4 DNA结合活性的影响[J]. 体育科学，2011，31(2)：55-62.

[20] Rose A G，Hargreaves M. Exercise increases Ca2+-calmodulin-dependent protein kinase II activity in human skeletal muscle[J]. J Physiol，2003，553：303-309.

[21] Hudmon A，Schulman H. Neuronal Ca2＋/calmodulin-dependent protein kinase II：the role of structure and autoregulation in cellular function[J]. Annu Rev Biochem，2002，71：473-510.

[22] Sumi M，Kiuchi K，Ishikawa T，et al. The newly synthesized selective Ca2＋/calmodulin dependent protein kinase II inhibitor KN-93 reduces dopamine contents in PC12h cells[J]. Biochem Biophys Res Communm，1991，181：968-975.

[23] Zheng D，MacLean P S，Pohnert S C，et al.Regulation of muscle GLUT-4 transcription by AMP-activated protein kinase[J]. J Appl Physiol，2001，91：1073-1083.

[24] Holmes B F，Sparling D P，Olson A L，et al.Regulation of muscle GLUT4 enhancer factor and myocyte enhancer factor 2 by AMP-activated protein kinase[J]. Am J Physiol Endocrinol Metab，2005，289：E1071-E1076.

[25] Young M E，Radda G K，Leighton B. Activation of glycogen phosphorylase and glycogenolysis in rat skeletal muscle by AICAR-an activator of AMP-activated protein kinase[J]. FEBS Lett，1996，382：43-47.

[26] Oshel K M. Knight J B，Cao K T，et al. Identification of a 30-base pair regulatory element and novel DNA binding protein that regulates the human GLUT4 promoter in transgenic mice[J]. J Biol Chem，2000，275(31)：23666-23673.