红榉不同种源核rDNA的ITS序列克隆与亲缘关系

王旭军， 程 勇， 吴际友， 张玖荣， 刘伟强

(1.湖南省林业科学院, 湖南 长沙 410004; 2.桑植县林业局, 湖南 桑植 427100)

红榉不同种源核rDNA的ITS序列克隆与亲缘关系

王旭军1， 程 勇1， 吴际友1， 张玖荣2， 刘伟强1

(1.湖南省林业科学院, 湖南 长沙 410004; 2.桑植县林业局, 湖南 桑植 427100)

通过克隆和测定核糖体DNA内转录间隔区(Ribosomal DNA internal transcribed spacer，rDNA，ITS)基因序列，研究红榉不同种源间的亲缘关系。测定结果表明：红榉5个种源的ITS序列、ITS1和ITS2长度变异范围分别为561～623 bp、157～210 bp和215～222bp。软件DNAMAN、遗传距离和UPGMA法系统发育树分析结果表明：南京种源与赣州种源的亲缘关系较近，湖州种源与怀化种源的亲缘关系较近；滁州种源单独聚为一类，与湖州、怀化种源的亲缘关系较远。

红榉； 种源； ITS； 亲缘关系

高等植物的细胞核中，核糖体DNA(rDNA)是由18S、5.8S和26S串联在一起的高度重复序列单位，而其间的内转录间隔区(Internal Transcribed Space，ITS)与编码区相比较，所受的选择压力小，进化速率较快[1]；同时，采用ITS构建系统发育树，比RAPD、AFLP、SSR和SRAP等技术更省时、省工，且结果也更加可靠[2]。因此，内转录间隔区(ITS)序列常常作为一种遗传标记，用来研究植物的系统发育[3-7]。红榉为大叶榉(ZelkovaschneiderianaHand-Mazz．)俗称，为榆科榉属落叶大乔木树种，因其材色浅红而得名，属国家二级重点保护植物。红榉生长较快，其材质坚硬有弹性，纹理美观有光泽，结构细致，为我国珍贵硬阔叶用材树种。同时，红榉树冠宽阔，树形优美，叶色季相变化丰富，春叶嫩绿，夏叶深绿，秋叶橙红，观赏价值高，是深受人们喜爱的传统色叶园林树种。此外，红榉还是药用、化工原料等方面的重要原料树种[8～11]。目前，关于红榉的研究主要集中在壮苗培育、高效栽培等方面[12～16]，而其种源亲缘关系的研究较少见。因此，本文对比分析了不同红榉种源的ITS序列, 旨在研究红榉不同种源间的系统发育和亲缘关系, 为红榉的引种、育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用材料为湖南怀化、浙江湖州、江西赣州、江苏南京和安徽滁州等5个红榉种源的2年生幼树叶片。

1.2 试验方法

1.2.1 基因组DNA提取 植物基因组DNA提取采取改进CTAB法。

1.2.2 PCR扩增ITS序列及产物纯化

(1) PCR扩增。ITS引物参照White等[17-18]的通用引物。引物序列：上游引物F(ITS5)为GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG，下游引物R(ITS4)为TCCTCCGCTTATTGATATGC。PCR扩增程序： 94℃下预变性4min；94℃变性30s，55℃退火30s， 72℃延伸30s，循环38次； 72℃延伸5min。PCR体系组分见表1。

表1 PCR体系组分Tab.1 ReactionsystemofPCR组分使用量(μL)DNA(30～50ng/μL)2.010×Buffer(25mM)2.5Mg2+(25mM)1.5TaqDNApolymerase(2u/μL)0.5dNTPMIX(10mM)0.5PrimerF(ITS5)(10μM)0.75PrimerR(ITS4)(10μM)0.75ddH2O16.5

(2) 测序。测序由上海生化工程技术服务公司完成。先使用通用引物M13在PTC-200上进行PCR反应，再用ABI3730全自动测序仪进行双向测序。

2 结果与分析

2.1 基因组DNA提取

将提取的红榉基因组DNA在1%的琼脂糖凝胶上点样，进行电泳检测，检测结果见图1。据图1可知，提取的所有种质基因组DNA电泳30min后，在凝胶成像系统下可见其DNA条带清晰，与MARKER进行比较，估计浓度约为50ng/μL，但含有少量RNA与蛋白质，可用于PCR扩增反应。

图1 琼脂糖凝胶电泳检测提取的基因组DNAFig.1 Extracted genome DNA of agarose gel electrophoresis

2.2 PCR产物回收与克隆

用提取的红榉基因组DNA作为模板，采用ITS引物扩增ITS序列，结果见图2a。据图2a可知，PCR扩增后条带清晰，扩增效果都较好，其中4号反应体系最为理想，可采用该体系进行PCR扩增。据图2b可知，5个不同种源的PCR扩增后，产物长度差异不明显，都在500～750bp之间，且条带清晰，无杂带，适合进行连接克隆。

图2 PCR产物及其纯化后检测图Fig.2 PCR products and theirs detection diagrams

图3显示，在AMP筛选培养基上，长出有多个转化后大肠杆菌克隆，菌斑边缘清晰，长势好，连接效果较为理想，仅有少量蓝色菌斑，表明仍有少量假阳性质粒，没有连接上PCR产物。

2.3 连接有PCR产物的重组质粒的提取及酶切鉴定

将提取的质粒进行电泳检测，结果如图4所示(6～10泳道)。图4中跑在最前面，条带最亮的是超螺旋结构质粒，大小2000bp左右，跑在中间的质粒为环状质粒，浓度相对较低，跑在最后面的质粒是直线形重组质粒。将重组质粒进一步进行酶切鉴定，结果见图4(1～5泳道)，1、3和5号泳道可能是因为酶切不完全，显示仍有三条带，最短带在750bp左右，最长带在2000bp左右。酶切结果表明，连接转化效果较为理想，PCR产物已成功导入质粒，挑取菌的斑带有目标ITS片段。

图3 重组菌在含氨苄青霉素选择培养基上生长Fig.3 Growth of recombinant E.coli on ampicillin media

2.4 ITS序列分析

5个红榉不同种源的ITS序列测序结果及ITS序列(包括5.8S在内)对比分析结果见表2。从表2可知，5个种源的ITS序列的长度范围是561～623bp，相差62bp，长度变异为9.95%，其中南京种源序列最长，为623bp。对序列长度分析可知，ITS1变化范围是157～210bp，ITS2变化范围是215～222bp，这5个种源ITS2都比ITS1长。5.8S序列相对保守，仅滁州种源为149bp，其他均为159bp，变化小。

图4 重组质粒与双酶切检测图Fig.4 The restriction analysis of recombinant plasmids

用软件DNAMAN对5个红榉种源的ITS序列进行两两比对，结果见表3。从表3中可知，湖州种源与怀化种源、南京种源、赣州种源及滁州种源的相似性分别为91.7%、89.5%、88.3%和79.5%；怀化种源与南京种源、赣州种源和滁州种源的相似性分别为88.5%、88.1%和79.6%；南京种源与赣州种源、滁州种源的相似性分别为93.3%和83.8%；赣州种源与滁州种源的相似性为85.6%。可见，湖州种源和怀化种源、南京种源与赣州种源均属于高度相似，而其它种源两两之间则均呈现中度相似。

表3 红榉不同种源序列相似度和遗传距离Tab.3 Geneticdistanceandidentityamongdifferentprovenances湖州HZ怀化HH南京NJ赣州GZ滁州CZ湖州HZ—91.789.588.379.5怀化HH0.083—88.588.179.6南京NJ0.1050.115— 93.383.8赣州GZ0.1170.1190.067— 85.6滁州CZ0.2050.2040.1620.144— 注:对角线下为遗传距离,对角线上为相似性(%)。

2.5 系统发育分析

红榉种源间的遗传距离用软件MEGA 4.0分析，其结果见表3。从表3中可以看出，湖州种源与怀化种源的遗传距离为0.083，湖州种源与南京种源、赣州种源的遗传距离分别为0.105和0.117，湖州种源与滁州种源的遗传距离为0.205；怀化种源与南京种源、赣州种源的遗传距离分别为0.115和0.119，怀化种源与滁州种源的遗传距离为0.204；南京种源与赣州种源的遗传距离为0.067，南京种源与滁州种源的遗传距离为0.162。表明，南京种源与赣州种源的亲缘关系最近，湖州种源与滁州种源的亲缘关系最远，怀化种源与滁州种源的亲缘关系也相对较远。

采UPGMA法获得红榉不同种源发育树(图5)。由图5可知，南京种源与赣州种源的亲缘关系较近，湖州种源与怀化种源的亲缘关系较近，而滁州种源则单独聚为一类。这些与遗传距离分析结果一致。

图5 基于ITS序列构建的红榉不同种源UPGMA系统发育树Fig.5 Phylogenetic tree of different provenances by UPGMA

3 结论

(1) 5个红榉种源的ITS序列的长度为561～623bp，ITS1序列的变异范围在157～210bp之间，ITS2序列的变异范围在215～222bp，ITS2都比ITS1长；5.8S序列相对保守，仅滁州种源为149bp，其他为159bp，变化小。

(2) 用软件DNAMAN对5个红榉种源的ITS序列进行两两比对得出，湖州种源和怀化种源、南京种源与赣州种源均属于高度相似，而其它种源两两之间则均呈现中度相似。

(3) 遗传距离和UPGMA法系统发育树的分析结果一致，即南京种源与赣州种源的亲缘关系较近，湖州种源与怀化种源的亲缘关系较近；滁州种源单独聚为一类，与湖州、怀化种源的亲缘关系较远。

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(文字编校：唐效蓉)

DeterminationofnucleotidesequencesofribosomalDNAinternaltranscribedspacerinZelkovaschneiderianacollectedfromdifferentprovenances

WANG Xujun1, CHENG Yong1, WU Jiyou1, ZHANG Jiurong2, LIU Weiqiang1

(1.Hunan Academy of Forestry, Changsha 410004, China; 2.Forestry Bureau of Sangzhi County, Sangzhi 427100, China)

The genetic relationship of different provenances ofZelkovaschneiderianawas investigated by cloning and measuring the sequences of the nucleotide sequences of ribosomal DNA internal transcribed spacers (ITS) collected from different parts of China. The results showed that the length of ITS sequence, ITS 1 and ITS 2 ranged 561～623 bp,157～210 bp and 215～222 bp, respectively. And the DNAMAN, genetic and UPGMA analysis revealed that the relationships between Nanjing provenance and Ganzhou provenance, and between Huzhou provenance and Huaihua provenance were closer than the others, and the Chuzhou provenances was clustered one single group.

Zelkovaschneideriana; provenance; ITS; genetic relationship

2013 — 05 — 19

国家“十二五”科技支撑计划(2011BAD38B03)。

王旭军(1971 — )，男，湖南省双峰县人，主要从事城市森林和林木遗传育种研究工作。

S 792.99

A

1003 — 5710(2013)04 — 0007 — 04

10. 3969/j. issn. 1003 — 5710. 2013. 04. 002