人胎盘AC133+造血干/祖细胞的集落形成能力

喻晓丹

（遵义师范学院生命科学学院，贵州遵义563002）

造血干/祖细胞（hematopoietic stem/progenitor cells，HPSC）普遍存在于骨髓（bone marrow，BM）、动员的外周血（mobilized peripheral blood，PB）和脐带血（umbilical cord blood，UCB）等组织中[1-3]。Takahashid等的研究发现，小鼠的胎盘具有造血功能[4]。近年来的研究表明，人胎盘组织富含造血干细胞，其CD34+细胞的百分率为脐带血的8.8倍[5，6]。AC133为近年来确立的一种新的HPSC特征性膜表面标志[7，8]。已有的研究表明，AC133仅表达于造血组织和有限的几种低分化肿瘤细胞株当中[9，10]，这不仅说明AC133标志比CD34更为原始，由此，有必要对胎盘组织 AC133+细胞组分的含量及其血细胞增殖分化能力作出评价。本实验采用免疫磁性细胞分选法（magnetic activated cell sorting，MACS）分选人胎盘组织AC133+，并用不同培养体系分别对其进行血细胞集落形成培养，以评价其增殖分化能力。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

Ficoll Histopaque购于 Sigma公司；IMDM、FBS、DES、EPO购于Gibco公司；IL-3、GM-CSF、Methylcellulose购于Intergen公司；AC133Mutisort免疫磁珠细胞分选试剂盒及 M iniMACS分离柱购于M iltenyi Biotee公司；荧光素标记单抗 AC133-PE McAb、M cAb购自BD公司；其余试剂均为分析纯。

1.2 胎盘的来源

足月分娩人胎盘，HbsAg-，胎盘于6h内进入实验程序。

1.3 胎盘组织（Placenta tissue， PT）单个核细胞（MNC）悬液的制备

用PBS清洗胎盘表面血迹，剪去胎膜后，多点全层剪取100g胎盘组织，再用PBS洗净残留的血液，将其剪碎，经机械分离（不锈钢网搓）得到胎盘组织单个核细胞（MNC）悬液，该过程在冰浴中进行。胎盘组织单个核细胞（MNC）悬液1500 rpm离心5m in，细胞沉淀用IMDM悬浮，Histopaque分选MNC，镜下计数 MNC，台盼蓝染色观察细胞活力（细胞活力>90%）。

1.4 PT-AC133+和PT-AC133-细胞亚群的免疫磁性分选

按AC133Mutisort试剂盒说明分选PT AC133+和AC133-细胞亚群。

1.5 胎盘细胞样品的流式细胞仪（FCM）分析

调细胞浓度至1×106/m L，于盛有20L相应单抗（AC133-PE、CD34-PE）的试管中加入100L细胞悬液，混匀，室温避光静置20min，1000 rpm离心5m in，弃上清，重新悬浮细胞。每管加入2m L含0.1%NaN3的PBS，混匀，1000 rpm离心 5 min，弃上清，再悬浮细胞；每管加入0.5m L1%的多聚甲醛，混匀，2～8ºC避光放置，上机分析。采用CellQuest软件对标记样品进行采集和分析（每管采集2×104个细胞）。MNC和AC133+细胞绝对计数用ProCOUNT软件采集和分析。AC133+细胞纯度按文献介绍的公式计算[4]。

1.6 血细胞集落形成培养

对从胎盘分选的AC133+、AC133-细胞分别进行CFU-GM、CFU-E、CFU-M ix培养。

1.6.1 CFU-GM培养

用琼脂培养体系进行CFU-GM培养。采用直径为35mm塑料平皿，种入1m L培养体系，培养基为RPM I1640，其中含20%FBS、5000个细胞、200U 粒细胞―巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），最后加入40℃保温的3%琼脂0.1m L，迅速混匀，静置冷却使之凝固，重复3个皿，37℃，5%CO2、饱和湿度条件下培养10～14d，观察CFU-GM形成情况。

1.6.2 CFU-E培养

用甲基纤维素培养体系进行CFU-E培养。采用直径为35mm塑料平皿，种入1m L培养体系，培养基为 IMDM，其中含 30%FBS、5000个细胞、10%0.1m L、10 U EPO、100 U IL-3、14.3 mM/L 2-ME 3L，最后加入2.7%甲基纤维素0.3m L，混匀，重复3个皿，37℃，5%CO2、饱和湿度条件下培养10 ～14d，观察CFU-E形成情况。

1.6.3 CFU-M ix培养

用甲基纤维素培养体系进行CFU-M ix培养。采用直径为35mm塑料平皿，种入1m L培养体系，培养基为IMDM，30%FBS、5000个细胞、10%0.1m L、10U EPO、PHA-LCM（植物凝集素-白细胞条件培养基）0.3m L、14.3 mM/L 2-ME 3L，最后加入2.7%甲基纤维素0.3m L，混匀，重复3个皿，37℃，5%CO2、饱和湿度条件下培养14～20d，观察CFU-M ix形成情况。

1.6.4 统计学处理

等甲洛洛激动的心情渐渐平复，他又想起自己肩负的使命，既然小丁不是小偷，那小偷一定另有其人，可又是谁呢？他又开始从头整理思绪：

集落数数据以均数±标准差（M±S）表示，若方差齐，采用 检验，若方差不齐，则采用 检验进行两样本间的比较。

2 结果

2.1 胎盘组织AC133+细胞组分的百分率

胎盘组织AC133+细胞组分的百分率见表1。

2.2 胎盘AC133+HSPCS的血细胞系集落形成能力

2.2.1 CFU-GM形成能力

经14d培养，胎盘AC133+细胞可见CFU-GM（见图 1-A），其 CFU-GM 数为（37±3）/1×103。胎盘AC133-细胞组分无CFU-GM形成。

表1 胎盘单个细胞中AC133+细胞数量

2.2 CFU-M ix形成能力

经14 d培养，胎盘AC133+细胞组分可见CFU-M ix形成（见图1-B），其集落形成数是（34±5）/1×103。而胎盘AC133-细胞组分无CFU-M ix形成。

2.2.3 CFU-E形成能力

经7d培养，胎盘AC133+细胞组分可形成CFUE，其集落数为（33±4）/1×103（见图1-C）。胎盘AC133-细胞组分无CFU-E形成。

胎盘 AC133+细胞亚群 CFU-GM、CFU-M ix、CFU-E的形成能力无显著差异（P>0.05）（见图2）。

图1 胎盘单个细胞CFU-GM、CFU-M ix F、CFU-GM集落形成图

图 2 PT-AC133+CFU-GM F、CFU-M ix、CFU-GM 集落形成数量比较

3 讨论

长期以来，一直认为CD34膜抗原是HSPC的特征性标志，并用于造血干细胞的分选、扩增和重建造血等研究[11]。AC133是近年来发现的一种新的造血干细胞表面标志，且越来越受到研究者重视[7，8]。M iraglia等的研究表明，AC133是一种5次跨膜糖蛋白，它不同于已知的4次和7次跨膜蛋白，是一种全新的跨膜蛋白，在早期造血调控中起重要作用[8]。最近由Yu等克隆并鉴定了一个新的AC133异构体，命名为C133-2，并证明它是造血干细胞表达的表面特征性标志[12]。AC133抗原主要表达于胎肝、骨髓和血液中CD34+造血干/祖细胞、所有非定向CD34+细胞及大多数定向于粒-单的CD34+细胞中[7]；AC133的表达在发育上早于CD34，并可替代CD34膜抗原标记成为分选、扩增和移植造血干/祖细胞的标志分子[13-15]。已有的研究涉及人骨髓、外周血、脐带血AC133+细胞，目前，关于胎盘组织AC133+细胞生物学特性的报道还很不全面、系统。采用AC133膜抗原标志来探索胎盘 AC133+细胞的造血干/祖细胞特性，可以补充该领域资料的欠缺。本实验结果表明，胎盘组织含有丰富的AC133+造血干/祖细胞。

集落形成实验是评价HSPC增殖分化能力的重要指标。近年来有研究表明AC133+细胞形成CFUM ix和高增殖潜能集落形成细胞(HPP-CFC)的能力强于CD34+细胞，AC133+细胞具有更强的增殖潜能，可能比 CD34+细胞更为原始并包含更多的原始HSPC[16]。目前的研究表明，AC133+造血干细胞具有很强的多向分化能力和长期造血重建能力[17，18]。外周血 AC133+CD34+细胞亚群中长期培养起始细胞（LTC-IC）比AC133-CD34+部分高得多[19]。人脐带血 AC133+细胞体外扩增中，AC 133+，AC133+CD34+，CD34+CD38-细胞的CFU-M ix和骨髓高增殖潜能集落形成细胞（HPP-CFC）的扩增倍数高于CD34+细胞，说明AC133是较CD34更为原始的造血干/祖细胞的表面标志，AC133+细胞具有更强的扩增潜力[12]。本研究在采用MACS分选人胎盘AC133+、AC133-细胞组分的基础上，分别对这两个细胞组分进行了各系集落培养，结果显示，胎盘AC133+细胞具有形成 CFU-GM、CFU-M ix、CFU-E的能力，AC133-细胞组分无此能力。这说明胎盘组织中的AC133+细胞组分具有HSPC特性，能够多向增殖并分化为多种造血祖细胞，AC133膜抗原标志可作为胎盘组织HSPC的分选标志。集落形成实验是评价造血干/祖细胞的客观指标之一，但因本实验的样本材料数量上不够大，故尚需作进一步的研究。并且，在全面评价胎盘 AC133+细胞作为 HSPC的一种新的来源之前，还需对其体外扩增能力、黏附分子表达与归巢能力、可塑性和造血重建能力等生物学特性进行研究。

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