变性高效液相色谱法检测晚期肺腺癌人类表皮生长因子受体2突变的探索性研究

赵莹莹 卢绍禹 杜文 梁洁 杨艳华

肺癌是全球总体发病率最高的恶性肿瘤，并且长期为首位的癌症类致死疾病[1-2]。肺癌根据病理形态可以分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，其中非小细胞肺癌占所有肺癌的85%左右，非小细胞肺癌又可以分为腺癌、鳞癌及大细胞癌。非小细胞肺癌大部分在发现时已经为晚期病例从而失去手术根治的机会，并且其5年生存率只有15%～16%。随着经济社会的发展，肺鳞癌的发生率有所下降，肺腺癌的比率不断上升，目前，已成为最常见的肺癌病理亚型。近年来，对于非小细胞肺癌尤其是肺腺癌的遗传学研究阐明了部分肺癌的发病机理，即EGFR、KRAS、HER2、ALK等基因突变导致了肺腺癌的发生并维持其生长[3-7]。针对特定驱动突变的靶向药物可以使肿瘤产生明显的消退，并显著延长患者无疾病生存期，针对EGFR酪氨酸激酶域突变的小分子抑制剂吉非替尼和厄洛替尼取得了很好的临床效果[3]。

人类表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor-2，HER2）基因，即c-erbB-2基因，定位于染色体17q12-21.32上。HER2基因异常表达、拷贝数增加和体细胞突变常见于许多种人类肿瘤，例如乳腺癌中常见到HER2的蛋白高表达和拷贝数扩增，这部分乳腺癌病例可能从单克隆抗体曲妥珠单抗治疗中获益[8]。前期的研究表明HER2基因构成肺腺癌突变谱的一个亚型，约3.8%的肺腺癌有HER2基因酪氨酸激酶域的突变，其中绝大部分为20号外显子YVMA非移码插入突变[7-9]。由于晚期肺癌病例往往难以取得足够的肿瘤组织标本进行基因测序诊断，如何有效地通过其他途径检测肿瘤体细胞突变是困扰肿瘤科医生的难题。DHPLC技术是一种高通量筛选基因序列突变的方法，具有快速和高敏感性的优点，已经证明可以检测到晚期肺癌患者血清中EGFR基因的突变[10]。本研究旨在探索DHPLC方法检测晚期肺腺癌患者血清中HER2突变的效果，扩展其应用范围。

1 资料与方法

1.1 一般资料 连续收集本院2006年9月-2010年5月收治的晚期肺癌患者血液样本，经外院已有病理诊断的晚期肺腺癌共52例。其中男31例，女21例，平均年龄（62.09±9.9）岁。其中吸烟者35例，不吸烟者17例；高分化、中分化和低分化肺腺癌分别占13.4%，50.0%和36.6%；Ⅲ期患者7例（13.4%），Ⅳ期患者45例（86.6%）。

1.2 DNA提取 采用QIAmp DNA Blood Mini kit进行血清DNA抽提，操作根据试剂盒提供的标准步骤。

1.3 PCR扩增 使用HER2基因20号外显子前后内含子引物对外显子进行PCR扩增，引物为5’-GCCATGGCTGTGGTTTGTGATGG-3’和5’-ATCCTAGCCCCTTGTGGACATAGG-3’。反应条件为：95 ℃ 2 min，95 ℃ 30 s，61 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s循环 36 次，72 ℃延伸10 min，1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增片段。

1.4 变性高效液相色谱分析 DHPLC检测使用WAVE4500核酸片段分析系统（Transgenomic公司），试剂主要包括TEAA和乙腈。步骤主要包括：（1）缓慢变性，95 ℃变性5 min，然后以0.03 ℃/s速率缓慢复性至25 ℃，使杂合子形成异源双链；（2）确定熔解温度，根据温度预测软件对DNA片段进行序列分析，确定熔解温度；（3）取10 μl缓慢变性PCR产物上样，分析流出峰峰形。

1.5 直接测序 对于DHPLC检测出可疑突变的样本，将PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后切胶回收，样本送商业测序公司进行检测。

2 结果

笔者共对52例收集到的晚期肺腺癌患者血清样本进行了检测。通过将野生型对照与检测样本1：5制成混合样本上机检测，结果见图1，共筛选到了3个可疑混合样本（图1 c、e、g）。重复进行的PCR直接测序对可疑的样本进行了验证，证实了混合样本中各有一个样本突变（图1 d、f、h）。HER2基因20号外显子的突变率为5.7%（3/52），所检出的突变得到了直接测序验证，均为YVMA非移码插入突变，未检出其他突变类型。

3 讨论

非小细胞肺癌尤其是肺腺癌的分子靶向治疗目前已经成为肺癌研究领域的热点。以EGFR酪氨酸激酶域小分子靶向抑制剂吉非替尼（易瑞沙）和厄洛替尼（特罗凯）为代表的靶向药物在世界范围内得到了广泛的应用。尤其对于有EGFR酪氨酸激酶域（18-22号外显子）激活突变的病例，应用吉非替尼和厄洛替尼可以产生显著延长患者的无进展生存期，其总体反应率可以达到70%以上。通过对肺腺癌突变谱的研究发现，除了EGFR之外，还有KRAS、HER2、ALK、ROS1、RET等基因突变或融合导致肿瘤的发生和进展。其中HER2突变是一种非常有靶向治疗前景的亚型。HER2基因的异常常见于很多中人类恶性肿瘤中，包括乳腺癌中的蛋白高表达和基因扩增，结直肠癌中的蛋白高表达，肺癌中的基因扩增和酪氨酸激酶域激活突变。在HER2基因高表达和基因扩增的病例，HER2单克隆抗体曲妥珠单抗（赫塞丁）治疗可以取得较好的效果。前期的研究表明，HER2基因在肺腺癌中突变率为3%～4%，在其他亚型的肺癌中没有报道，表明HER2突变代表了一个亚型的肺腺癌，有希望从针对HER2的靶向治疗中获益。

在晚期肺癌的基因靶向治疗中，另一个影响准确分子分型诊断和治疗的因素是往往无法获得足够的肿瘤组织标本进行基因诊断。晚期肺癌患者基础身体条件往往较差，患者及家属可能不愿接受气管镜活检甚至经皮肺穿刺活检。传统的活检一般以明确病理诊断为目的，难以获取足够多的组织再次进行基因诊断。因此，探索通过其他标本来检测肺癌突变具有重要的临床意义。由于近年来分子生物学实验仪器的进步，通过外周血液中捕获肿瘤细胞或肿瘤细胞崩解后释放的基因片段，进而利用高敏感度的检测成为了现实。其中DHPLC技术因其具有高通量和超高敏感度的优势引起了研究人员的注意。在之前的研究中，研究人员已经成功利用这一技术检测了晚期肺癌患者外周血中EGFR基因的常见突变，并通过与对应肿瘤组织的测序研究证实了这一技术路线的准确性和可行性。在本研究中，笔者使用DHPLC技术对晚期肺腺癌患者外周血样本进行了检测和验证，共发现了3例（5.7%）HER2 20号外显子插入突变，并且得到了直接测序的验证。直接测序的验证中两例突变峰较低（图1 f、h），这一结果符合肿瘤细胞DNA含量较低的预期。

图1 DHPLC检测晚期肺腺癌患者血清HER2基因突变片段

总之，笔者的探索性实验研究表明，在晚期肺腺癌患者外周血液样本中可以使用DHPLC技术检测HER2基因的突变。通过实验过程中设置阴性对照和阳性对照进行质量控制，这一方法可以准确检出基因突变，为晚期肺癌患者获得基因诊断提供了新的检测方法，使这部分患者有机会接受靶向治疗并从中获益。

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