奥氮平有关物质的HPLC检查法研究

林 洁，程煜凤，康秋梅，李祖琨，李 丹，康天怿，徐小平

（1.四川大学华西药学院，四川 成都 610041；2.新疆医科大学药学院，新疆 乌鲁木齐 830011）

0 引 言

奥氮平（olanzapine）化学名为 2-甲基-4-（4-甲基-1-哌嗪基-）-10H-噻吩并[2，3-b][1，5]苯并二氮杂卓，是一种非典型抗精神病药，可有效改善精神分裂的阳性及阴性症状，锥体外系反应[EPS]发生率低[1]，具有神经保护作用[2]，可改善老年期痴呆的精神行为症状，广泛用于治疗多种精神疾病[3-6]。其质量标准收载于美国药典（USP34-NF29）及国家药品标准（WS1-（X-181）-2004Z）中。针对其有关物质研究的文献资料较少，且主要采用高效液相色谱法[7]进行检查，所报道的色谱条件及限度有较大差异。本文在对比验证标准方法和实验室建立的方法基础上，根据有关物质的分离个数、分离度、峰高和分析时间，筛选并优化出奥氮平有关物质检查的HPLC条件，为奥氮平质量研究提供快速、简便、灵敏的方法。

1 实验材料与方法

1.1 仪器

Shimadzu LC-2010AHT高效液相色谱仪（日本岛津公司），色谱工作站（日本岛津公司）；纯水仪（成都品成科技有限公司）；BP211D型十万分之一电子分析天平；KL10260D超声波清洗器。

1.2 试剂

奥氮平对照品（批号：100948-200801，中国药品生物制品检定所）；奥氮平原料药（批号：ODOON1206001，浙江新华制药有限公司）；乙腈为色谱纯（广东光华科技股份有限公司）；甲醇为色谱纯（天津市科密欧化学试剂有限公司），纯化水，其他试剂均为分析纯。

1.3 方法

1.3.1 奥氮平有关物质研究的3种HPLC方法比较

参照奥氮平在美国药典标准（USP34-NF29，以下简称USP法）、国家药品标准（WS1-（X-181）-2004Z，以下简称WS法）和实验室参照文献建立的方法（以下简称自建法）中所收载的3种HPLC有关物质检查法（均采用主成分自身稀释对照法定量），分别对奥氮平中有关物质进行了分离考察，记录了色谱峰，并就有关物质的个数、检测限、分离度、对称性和柱效等方面进行了比较。分析条件见表1。

表1 奥氮平有关物质分析方法色谱条件比较

表2 USP法梯度洗脱程序

检出限：取适量供试品，用流动相溶解并逐级稀释成不同浓度的供试品溶液，分别取20μL进样，最小杂质峰高的信噪比≥3时，确定杂质检出限。

1.3.2 测定方法的优化

根据上述3种色谱法的特点，本文设计了不同类型固定性、柱长和洗脱形式，以奥氮平原料药中有关物质的检出个数、分离度、峰高、分析时间和基线漂移等作为优化其HPLC条件的指标，评价条件见表3。

2 结果与讨论

2.1 3种测定奥氮平有关物质方法比较

由图1可知，USP法采用的是梯度洗脱法，分离得到USP法指定的奥氮平5个主要杂质峰，但是基线漂移较严重，奥氮平主峰后的另一个杂质峰（1，4-二（2-甲基-10H-苯并（b）噻吩并[2，3-e][1，4]二氮杂-4-基）哌嗪）体现不明显，且分析时间相对较长，可能与固定相类型（C8）和柱长（250mm）有关；WS法采用恒比例洗脱法，分离得到4个主要的杂质峰，响应值高，相对分析时间最短，基线平稳，但几乎没有完全分离的峰；自建法用比例洗脱得到6个主要杂质峰，主峰后的杂质峰体现明显，峰分离度均大于1.5，基线平稳，但灵敏度相对较低。因3种方法各自的固定相类型，柱长、流动相和洗脱类型的差异，直接比较尚有不足，需要进一步优化。

表3 不同优化条件表

图1 3种方法的色谱图比较

2.2 测定方法的优化

实验采用不同类型、不同柱长3种色谱柱，分别参照上述3种奥氮平有关物质检查方法的HPLC条件，测定奥氮平原料药中有关物质，测定主要结果如图2所示。

图2 不同色谱柱参照不同色谱方法实验结果

据实验数据分析，相同色谱柱下比较不同洗脱方法，USP法采用的是梯度洗脱，且流动相中存在SDS缓冲盐，所以基线漂移较大，分析时间也较长，而采用WS法和自建法的等度洗脱程序的基线较平稳。在使用 C18柱（150mm×4.6mm×5μm）和C8柱（150mm×4.6mm×5 μm）时，自建法分离杂质峰相对较多，峰分离度大，分析时间合适，因此自建法较WS法以及USP法在杂质分析上具有一定优势。在采用C8柱（250 mm×4.6 mm×5 μm）情况下，USP 法分离得到杂质多，峰分离度均大于1.5，灵敏度高，分析时间短，因此，C8柱（250mm×4.6mm×5μm）情况下，参照USP法梯度洗脱程序杂质分离更好。在不同柱子情况下比较，等度和梯度各具有优势，但考虑分析时间及对实验设备的要求，以及基线漂移对杂质分离影响的情况，自建法的等度洗脱更具实用性和合理性。

在相同方法下比较不同柱子，参照USP法梯度洗脱程序，采用的 C8柱（250mm×4.6 mm×5 μm），分离杂质峰数多，分离度高，基线漂移相对较小，分离情况最为理想。参照WS法的等度洗脱程序，C18柱（150mm×4.6mm×5 μm）灵敏度最高，分离情况相对理想。自建法的等度洗脱程序，考虑分析时间，峰分离个数及响应值，C18柱（150mm×4.6mm×5μm）分离分析情况理想。一般情况下洗脱程序相同，同一类型色谱柱杂质峰分离个数应一致，但自建法的C8（250mm）柱比C8（150mm）分离杂质数少，原因是柱长增加，采用等度洗脱时谱带展宽严重，导致含量很低的杂质峰高过小，所以能积分的杂质峰变少。根据以上分析可知，美国药典标准、国家药品标准中收载的方法，以及实验室自建的方法，在柱子的类型及柱长选择上具有明显优势，因此在分别采用各方法进行分析时，推荐采用原方法中的色谱柱。

图3 实验室自建方法奥氮平有关物质HPLC图

3 结束语

结果表明，固定相的类型在分离中影响不明显，柱长增加有利于分离度的改善，但是分析时间会明显增长。综上可知，自建法具有检出杂质个数多、分析时间较短、分离度较高、灵敏度较高和基线平稳等特点，是奥氮平有关物质限量检查的较好方法。

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