犬干扰素IFN-γmRNA表达规律研究

杨 敏 刘 军

仔犬是指45日龄以内的犬即从母体分娩到断奶阶段的犬。这一阶段的犬生长发育旺盛而不完善。为保障仔犬发育，食物的转换（从母乳哺乳到采食）与免疫接种是必要的。饲养管理的调整作为应激因素影响仔犬的免疫应答能力，从而影响其抗病能力。IFN-γ（Interferonγ）属淋巴细胞干扰素，是由活化的T 淋巴细胞在诱生剂等作用下产生的糖蛋白、具有免疫调节功能。它参与诱导主要组织相容性复合体类抗原的表达、增强T 辅助细胞抗体产生的免疫调节效应。IFN-γ也是动物巨噬细胞的主要活化因子。作为犬机体免疫能力的标示物，IFN-γ mRNA 检测用于评估心脏病患犬的免疫调节能力以及杜氏利士曼原虫、新孢子虫等寄生虫病时犬T CD8+细胞数量及活性。本试验拟探讨20 ～45日龄仔犬IFN-γ mRNA 表达规律，以期揭示仔犬生长发育规律并完善饲养管理方案。

一、材料与方法

（一）实验动物

实验犬为德国牧羊犬仔犬，6 窝共计33 头，由沈阳警犬基地分窝饲养。犬舍约12m2，分为室内、室外，可自由活动，不限制饮水。小于20日龄的仔犬饲喂母乳，20日龄仔犬接受驱虫（药物为左旋咪唑）；大于20日龄小于45日龄仔犬补饲米粥、肉沫粥等流食；35日龄仔犬接受免疫接种（荷兰英特威犬瘟热病毒、犬细小病毒二联苗）；大于45日龄仔犬断奶、饲喂全价犬粮。20日龄实验犬为第1 组、35日龄为第2 组、45日龄为第3 组。

（二）主要试剂

RNAiso Plus、TaKaRa RNA PCR Kit(AMV) Ver.3.0、TaKaRa DL2000 为TaKaRa 公司产品，GeneFinder 为百维信公司产品，EDTA、Tris、硼酸、琼脂糖为Sigma 公司产品，异丙醇、氯仿、75%酒精为江莱生物科技有限公司产品。

（三）血样采集

采集20日龄（驱虫前）、35日龄（免疫接种前）、45日龄仔犬前肢头静脉血1ml（肝素抗凝剂），-80℃保存。

（四）总RNA 提取及纯度检测

参照试剂盒操作过程，每250μl 全血加入1.5ml RNAiso。酶标仪检测RNA 纯度，取RNA0D260/0D280值在1.7～2.0 范围内的样品-80℃冻存。

（五）犬IFN-γ mRNA 表达量检测

采用Trizol 法从全血中抽提总RNA，以cDNA 为模板，进行犬IFN-γ、GPDH 基因cDNA 的PCR 扩增。用于扩增犬IFN-γ、GPDH 基因的引物参照文献设计。引物由北京三博远志生物技术有限责任公司合成，序列见表1。反转录体系为10μl：MgCl2 2μl、10×RT Buffer 1μl、dNTP Mixture (10Mm) 1μl、RNase inhibitor 0.25μl、AMV Reverse Transcriptase 0.5μl、Oligo dT-Adaptor Primer 0.5μl、RNA Sample 2μl。PCR 反应体系为25μl：5×PCR Buffer 5μl、TaKaRa EX Taq HS 0.125μl、上下游特异引物各0.25μl (各20Mm)、反转录反应液2μl。反转录反应条件：42℃ 30 min；99℃ 5 min；5℃ 5 min。PCR 反应条件：94℃ 2 min；94℃ 30 s，53℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 4 min，4℃保存结束。PCR 产物进行2% 琼脂糖凝胶电泳，结果经G：box 凝胶成像系统成像、GeneTool 软件分析得出各基因的灰度值。计算目标基因与内参基因灰度值的比值（IFN-γ／GPDH）后，进行半定量分析。

（六）数据的统计处理

SPSS.13.0 统计分析20日龄、35日龄、45日龄时仔犬IFN-γ mRNA 检出率及表达差异，计算x2、P 值。

表1 引物序列

二、结 果

（一）全血中提取总RNA

使用RNAiso Plus 从犬前臂头静脉全血中提取总RNA，电泳结果见图2-1。

（二）RT-PCR 产物

使用TaKaRa RNA PCR Kit(AMV) Ver.3.0 得到RTPCR 产物，GPDH 大小为283bp、IFN-g 大小为203bp，见图2-2。

图2-1 全血总RNA 提取结果电泳图 泳道M:DL2,000、泳道1、4：新鲜的全血样品、泳道2、3：-80℃保存的全 血样品。

图2-2 IFN-g 、GPDH RT-PCR 扩增产物电泳图。泳道M: DL2,000、泳道1：20日龄IFN-g 产物、泳道2：20日龄GPDH产物、泳道3：35日龄IFN-g 产物、泳道4：35日龄GPDH 产物、泳道5：45日龄IFN-g 产物、泳道6：45日龄GPDH 产物。

(三)20、35、45日龄IFN-g mRNA 检出率、相对表达量及差异分析

受试组中20日龄组IFN-g mRNA 的检出率最高为57.6%。随日龄增加，35日龄、45日龄组IFN-g mRNA 检出率显著下降（x2=6.628、P=0.036）。45日龄组IFN-g mRNA表达量极显著高于20日龄、35日龄组（P＜0.001）。20日龄组、35日龄组IFN-g mRNA 表达差异不显著（P＞0.05）。

表2-1 20、35、45日龄组IFN-γ mRNA 检出率及表达量

表2-2 20、35、45日龄组IFN-γ mRNA 表达差异

三、讨 论

仔犬的饲养管理是犬养殖成功与否的关键。处于这一时期的犬生理机能不健全、各组织器官的适应能力和抗病力都很差。仔犬出生到断乳时因各种原因导致的死亡率高达34%。实验结果显示小于20日龄的仔犬在母乳饲喂条件下，IFN-g mRNA 检出率为57.6%，显著高于35日龄、45日龄添加米粥的饲喂条件下的检出率。这一研究结果说明母乳可为一半以上的仔犬营造一个良好的营养环境，促进仔犬发育阶段犬免疫系统的生长发育、提高仔犬免疫能力，进而发挥疾病预防和促进远期健康的作用。母乳仍是目前养犬业最应提倡采用喂养仔犬的食物。不仅营养需要，在味觉、消化吸收等方面乳类食品也是仔犬最适合的食物。研究表明新生仔犬胃肠道对高分子物质的吸收能力较成年犬高出一百倍。质量高、数量充足的母乳获取是短期内激发仔犬系统免疫的关键。但最低的IFN-g mRNA 表达量同时也说明母乳对仔犬机体免疫调节功能是有限的。饲养管理者应考虑母犬的泌乳量一般在21 天左右达到高峰后逐渐下降，初乳与乳内免疫球蛋白的含量相差较大等情况，合理安排仔犬哺乳期的长短、适时断奶：哺乳期过短，仔犬生长发育缓慢，成年后生产力低；哺乳期过长，母犬发情、配种延后，影响正常繁殖过程。同时，研究显示犬是可以通过胎盘和泌乳两种途径将免疫球蛋白传递给子代的动物。饲养管理者也可以通过母犬被动免疫等方法提高乳汁营养含量，从而加强仔犬免疫能力。

仔犬免疫系统随着犬龄的增长不断向前发育成熟。实验结果显示随着犬龄增长，IFN-g mRNA 表达量于35日龄时有所增加但并不明显，45日龄时则表现出极显著增加。这说明仔犬的免疫系统已经向前发育。35日龄、45日龄组IFN-g mRNA 较低的检出率同时说明仔犬免疫系统发育存在个体差异性：发育良好的仔犬在45日龄时已经拥有较强的免疫调节能力，而大部分仔犬还几乎没有。为大于20日龄的仔犬补料（逐渐在奶中添加牛奶、米汤、稀饭逐渐过渡到添加蛋羹和肉末等营养价值高易消化的食物）是保证生长发育正在上升阶段的仔犬营养需求的关键。35日龄组仔犬IFN-g 检出率显著下降、IFN-g mRNA 表达量略高于20日龄说明补料是不足够的，饲养管理者可以通过添加复方苦芩等中药、提早免疫接种等方式增强仔犬免疫调节能力。

综上所述，仔犬发育阶段，IFN-γ mRNA 表达个体差异显著、检出个体表达量随日龄增长而增加。目前，饲养管理可以通过加强母犬断奶前营养、尽量选择有免疫佐剂功效的驱虫药、选取仔犬免疫力空白期实施被动免疫等方法保证犬健康地度过仔犬发育阶段。幼犬发育阶段IFN-γ mRNA 表达规律有待于进一步研究。