猪卵母细胞体外成熟培养的研究

王艳萍 曾维斌 杨顺邦 贺昌萍

(塔里木大学动物科学学院/新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室，新疆 阿拉尔 843300)

随着胚胎工程技术的研究与应用，卵母细胞作为实验材料，对其需求量也越来越大，因此，建立并完善卵母细胞体外成熟培养(IVM，in vitro maturation)体系可为研究胚胎发育生物学、iPS、人类器官移植以及转基因动物、核移植等技术的研究提供材料保障。卵母细胞成熟是指卵母细胞恢复和完成第一次减数分裂，进入并停滞于第二次减数分裂中期(MⅡ)，此间伴随核成熟和胞浆成熟两个方面，核成熟是核膜破裂，同源染色体分离和排出第一极体，胞浆成熟是胞浆内各种蛋白组成达到一定水平及线粒体的有效重排［1］。在体内卵母细胞是在卵泡内发育成熟的，卵泡大小对卵母细胞的成熟及受精后发育潜力起着至关重要的作用，促卵泡素(FSH)与促黄体素(LH)是参与卵母细胞成熟的最重要的蛋白质激素，可促进颗粒细胞增殖、膨散，LH 与受体结合，可促进卵母细胞成熟，大大提高体外培养成熟率［2］。因此，本实验利用屠宰场废弃的猪卵巢采集的卵母细胞，研究卵泡液、激素和卵泡大小对猪卵母细胞体外成熟的培养的影响，为进一步的科学研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 成熟培养液的基础液配制

以TCM199+10% FCS 为基础，添加3.05 mMol/L葡萄糖、0.91mMol/L丙酮 酸 钠、0.57 mMol/L L－ 半胱氨酸、75μg/ml 青霉素、50 ug/mL链霉素，定容、过滤、分装，4℃保存备用。

FSH (促卵泡素)、LH (促黄体素)、PMSG (孕马血清促性腺激素)是宁波激素制品厂生产，其它试剂如未特别注明，均购自Sigma 公司。

1.2 猪卵泡液的制备

用10 mL 注射器带12 号针头，从卵巢表面直径4～7 mm的卵泡中抽取猪卵泡液。抽取的卵泡液放入1.5 mL 离心管中，2 000 rpm 离心20 min，取上清液于0.22 um的滤器过滤后，分装并储存于－20℃冰箱中备用。

1.3 卵母细胞的获得

从屠宰场采集新鲜猪卵巢，保存在加青、链霉素的不低于30℃的生理盐水中，2h 内送至实验室。卵巢经无菌的生理盐水中洗3 遍，用带12 号针头的注射器(10 mL)抽取卵巢表面的卵泡液，静置、弃上清液后在体视显微镜下捡卵。只吸取A、B 级的COCs(卵丘－卵母细胞)，再经mTCM199 液洗3 次后，放置在成熟培养液液滴中进行培养。

1.4 卵母细胞的成熟培养分组

实验1 以TCM199 +10% FCS(胎牛血清)为主的基础液为对照组。再添加不同浓度5%、10%、20%的猪卵泡液。

实验2 以TCM199 +10% FCS+10% PFF(猪卵泡液)做对照组。再添加50 ug/ml FSH、LH、PMSG。

实验3 根据实验2 确定的最优成熟培养液后，根据卵泡直径的大小将其划分为≤3 mm、4～7 mm和≥8 mm 三个等级，然后分别用吸取卵泡中的卵母细胞进行培养。

1.5 卵母细胞的体外成熟

将含有不同培养液的COCs的液滴培养皿放在5%CO2的空气、饱和湿度的CO2培养箱中进行培养。44 h 后将COCs 置于实体显微镜下观察卵母细胞是否有第一极体的排出，以此作为判断成熟的标准。

1.6 数据处理

试验所得数据采用SPSS 单因素方差分析，试验重复数为6 次。

2 结果与分析

2.1 添加不同水平的猪卵泡液对COCs 成熟的影响

从表1 可以看出，添加10%猪卵泡液的试验C组，其卵母细胞的成熟率要显著(P＜0.05)高于分别添加对照组、5%与20% PFF的试验组，B、D 组之间差异不显著，但其成熟率也要高于(P＜0.05)对照组。故实验2 将以C 组液为对照组。

表1 猪卵泡液不同添加水平对COCs 成熟的影响

2.2 添加不同种类的激素对COCs 成熟的影响

由表2 可以看出，B 组添加50 ug/ml FSH的卵母细胞成熟率最高，显著高于(P＜0.05)其它三组。添加50 ug/ml LH的C 组和添加50 ug/ml PMSG的D 组之间差异不显著，但均显著高于(P＜0.05)对照组。

表2 添加不同种类的激素对COCs 成熟的影响

2.3 不同直径卵泡对COCs 成熟的影响

由表3 可以看出，来自于直径4～7 mm 大小卵泡的卵母细胞，在相同培养条件下其成熟率显著高于(P＜0.05)≤3 mm 和≥8 mm的实验组。卵泡直径≥8 mm 实验组显著高于(P＜0.05)≤3 mm的实验组。

表3 不同直径卵泡对卵母细胞体外成熟的影响

3 讨论

哺乳动物的卵母细胞在体外成熟中，卵泡液是重要的影响因素之一。猪卵泡液是卵泡中血清渗出物经过新陈代谢活动改变过的产物，包含有特殊成分，如卵泡壁细胞合成的类固醇和糖蛋白，卵泡液对卵母细胞生长发育有促进作用。刘晓辉等人［3］在TCM199 与NCSU－23 为主的培养液中添加猪卵泡液的对比试验中，添加组都比对照组显著提高了卵母细胞的培养成熟率。而本试验设计不同添加水平的猪卵泡液培养卵母细胞，证明添加浓度为10%的猪卵泡液能更好地促进猪卵母细胞的成熟。

在卵母细胞体外成熟过程中，激素是促进胞质成熟的重要成分。秦鹏春［4］等认为，FSH 和LH 对猪卵母细胞IVM 和排卵起到主要作用，Shimada［5］等认为前20 h 添加FSH+LH，而后20 h 不添加FSH+LH，IVM 效果更好。马红［6］在研究促卵泡素对奶牛卵母细胞体外成熟的影响时发现，一旦在成熟培养液中添加FSH，卵母细胞的成熟率也立刻上升，而通过不同浓度的对比发现，随着FSH 浓度上升，卵母细胞成熟率也随之上升，FSH 浓度最终决定了成熟卵母细胞的数目，当浓度达到50 ug/ml 时在促进卵母细胞成熟方面具有最佳作用。故本试验采用了这一剂量来研究单独使用不同激素添加物对IVM的影响，结果发现FSH 对猪卵母细胞成熟的效果更优。

卵泡作为哺乳动物卵母细胞生长和成熟的环境，其对卵母细胞的成熟起着至关重要的调节作用。卵泡直径为0.5～1.6 mm 小卵泡内卵母细胞正进行RNA的合成，而大卵泡内的卵母细胞已贮存了足够的RNA 以分成蛋白质，故大卵泡内卵母细胞的体外成熟率高。Yoon 等［7］研究发现3－8 mm 直径卵泡的卵母细胞成熟率显著高于小于3 mm 卵泡的卵母细胞。猪卵泡直径过大或过小，卵母细胞成熟能力均降低。大卵泡内的细胞已成熟或过成熟，小卵泡内细胞却未发育成熟，只有3～5 mm 组卵泡的卵母细胞是生长旺盛期适宜IVM［8］。本试验结果表明，来自于直径4～7 mm 大小卵泡的卵母细胞，在相同培养条件下其成熟率显著高于(P＜0.05)≤3 mm 和≥8 mm的实验组。该结果与华冉东等人［9］的试验认为来自猪卵泡3～6 mm的卵母细胞培养成熟率最好的结果相似。

［1］Michelson A L.In vitro maturation of human oocytes［J］.Intern Congre Series，2004，1266:160－166.

［2］周洪彬，肖雄，包磊，等.猪体外胚胎生产的研究进展［J］.中国农业科学，2005，39(7):1457－1463.

［3］刘晓辉，曹阳，郎洪彦，等.培养液对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎早期体外发育的影响［J］.安徽农业科学，2011，39(20):12229－1223.

［4］秦鹏春，谭景和，吴光明，等.猪卵母细胞体外成熟和受精的研究［J］.中国农业科学，1995，28(3):58－66.

［5］Shimada M.Terada T.FSH and LH induce progesterone production and progesterone receptor synthesis in cumulus cells:a requirement for meiotic resumption in porcine oocytes［J］.Molecula Human reproduction，2002，8(7):612－618.

［6］马红.促卵泡素对奶牛卵母细胞体外成熟的影响［J］.家畜生态学报，2009，30(5):33－35.

［7］Ki－Won Yoon，Tae－Young Shin，Tong－Im Park，et al.Development of porcice oocytes from preovulatory follicles of different sizes after maturation in media supplemented with follicular fluids［J］.Reproduction，Fertility and Development，2001，12(4):133－139.

［8］陈晓宇，李青旺，胡建宏.不同直径卵泡对猪卵母细胞体外成熟的影响［J］.西北农林科技大学学报(自然科学版)，2004，32(7):56－60.

［9］华再东，郑新民，魏庆信，等.猪卵母细胞体外成熟的影响因素［J］.华中农业大学学报，2011，30 (3):280－284.