正交试验优选叉枝鸦葱水溶性多糖的提取工艺

王安银 孟庆艳 李金凤 付江花 白红进

(1 塔里木大学生命科学学院，新疆 阿拉尔843300)(2 新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室，新疆 阿拉尔843300)

叉枝鸦葱(Scorzonera divaricata Turcz.)系菊科、鸦葱属、多年生草本植物，又名拐轴鸦葱、杈枝鸦葱、分枝鸦葱等，是一种耐旱、耐盐植物，主要分布于草原、半荒漠、荒漠地带、戈壁和干涸床上，具有固定沙丘、美化环境的作用。鸦葱始载于《救荒本草》，具有清热解毒，消肿散结的功能，主治疗疮痛瘟，乳痛，跌打损伤，劳伤，疗疮痛肿和妇女乳房肿胀［1］。目前，国内研究人员对叉枝鸦葱的化学成分研究主要有鞣质［2］，生物碱［3］，黄酮［4］，尚未见对南疆叉枝鸦葱水溶性多糖研究报道。本研究采用苯酚－硫酸法［5］测定多糖的含量，以多糖的提取率为考察指标，通过正交试验优选出叉枝鸦葱水溶性多糖的最佳提取工艺，为其进一步的研究提供参考依据。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

紫外－可见分光光度计T6 新世纪(北京普析通用仪器有限责任司);电子天平BS124S(北京赛多利斯仪器系统有限公司);电热恒温鼓风干燥箱DHG－9101－2SA 型(扬州鸿都电子有限责任公司);数显恒温水浴锅DK－8D(金坛市医疗仪器厂);旋转蒸发仪Re－50B(上海申生科技有限公司)。

1.2 试剂

葡萄糖，无水乙醇，石油醚，浓硫酸，苯酚，氢氧化钠，无水硫酸铜，亚铁氰化钾，酒石酸钾钠，次甲基蓝，硝酸银，α－萘酚，铁氰化钾等均为国产分析纯;实验用水为蒸馏水。

2 材料与方法

2.1 材料

2010年5月于新疆阿拉尔沙漠采集叉枝鸦葱地上部分，自然阴干，粉碎，过60 目筛，备用。经塔里木大学植物科学学院刘艳萍老师鉴定为菊科叉枝鸦葱(Scorzonera divaricata Turcz.)植物。

2.2 方法

2.2.1 采用苯酚－硫酸法测定叉枝鸦葱水溶性多糖的含量。

2.2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取经105℃干燥24 h 后的葡萄糖0.01 g，加水溶解并定容至100 mL 容量瓶中，摇匀，即得。

2.2.1.2 供试品溶液的制备 称取样品粉末1 g，加30 mL 蒸馏水，80℃水浴回流提取1.5 h，提取1次，抽滤置于100 mL 容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，即得。

2.2.1.3 测定波长的选择 准确量取对照品溶液和供试品溶液各1 mL，分别置于10 mL 具塞试管中，依次加入6%苯酚1.0 mL，浓硫酸5.0 mL 摇匀，静置约5 min 后在沸水浴中水浴15 min，冷却水冷却至室温，然后以蒸馏水做空白，按照紫外－可见分光光度法，在200－800 nm 范围内进行扫描，确定最大吸收波长为490 nm(结果见图1)。

图1 样品和葡萄糖的紫外－可见吸收光谱

2.2.1.4 葡萄糖标准曲线的制作 准确吸取对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL 分别置于10 mL 具塞试管中，加蒸馏水至2.0 mL，依次加入6%苯酚1.0mL，浓硫酸5.0 mL 摇匀，静置约5 min 后在沸水浴中水浴15 min，冷却水冷却至室温，然后以蒸馏水做空白，于490 nm 处测定吸光度。以葡萄糖浓度(C)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标制作葡萄糖标准曲线。得回归方程为:A=10.266C+0.012(r=0.9992)，说明葡萄糖质量浓度在0.01－0.07 mg/mL 范围内与吸光度呈良好线性关系。

2.2.2 提取工艺研究

2.2.2.1 单因素考察试验 以固液比、提取时间、提取次数、提取温度为考察因素，考察其对叉枝鸦葱水溶性多糖提取率的影响。

2.2.2.2 正交试验 在单因素试验的基础上，采用L9(34)正交试验设计［6］，选固液比、提取时间、提取次数、提取温度为考察因素，进行4 因素3 水平试验，研究叉枝鸦葱水溶性多糖的最佳提取工艺。

3 结果与分析

3.1 单因素考察试验结果

3.1.1 固液比对多糖提取率的影响 准确称取干燥至恒重的叉枝鸦葱样品5.000 0 g，在提取时间为1 h，提取次数为1 次，提取温度为80℃的条件下，研究固液比对叉枝鸦葱多糖提取率的影响，设计固液比为1:25，1:30，1:35，1:40，1:45，1:50，实验结果如图2 所示。

图2 固液比对多糖提取率的影响

图3 提取时间对多糖提取率的影响

由图2 可知，随着固液比的增加，叉枝鸦葱多糖提取率呈现出先增加后减小的趋势，当固液比增加到1:40(m/v)时提取率达到最大值;固液比继续增加时提取率则有所下降。因此叉枝鸦葱多糖提取的固液比确定为1:40(m/v)。

3.1.2 提取时间对多糖提取率的影响 准确称取干燥至恒重的叉枝鸦葱样品5.000 0 g，在固液比为1:40(m/v)，提取次数为1 次，提取温度为80℃的条件下，研究提取时间对叉枝鸦葱多糖提取率的影响，设计提取时间为0.5，1，1.5，2，2.5，3 h，实验结果如图3 所示。

由图3 可知，随着提取时间的增加，叉枝鸦葱多糖提取率呈现出先增加后减小的趋势，当提取时间增加到1.5 h 时提取率达到最大值;提取时间继续增加时提取率则有所下降。因此叉枝鸦葱多糖提取的提取时间确定为1.5 h。

3.1.3 提取次数对多糖提取率的影响 准确称取干燥至恒重的叉枝鸦葱样品5.000 0 g，在固液比为1:40(m/v)，提取时间为1 h，提取温度为80℃的条件下，研究提取次数对叉枝鸦葱多糖提取率的影响，设计提取次数为1，2，3，4 次，实验结果如图4 所示。

图5 提取温度对多糖提取率的影响

由图4 可知，随着提取次数的增加，叉枝鸦葱多糖提取率呈现出先增加后减小的趋势，当提取次数增加到3 次时提取率达到较大值;提取次数继续增加时提取率增加量较小。因此叉枝鸦葱多糖提取的提取时间确定为3 次。

3.1.4 提取温度对多糖提取率的影响 准确称取干燥至恒重的叉枝鸦葱样品5.000 0 g，在提取时间为1 h，提取次数为1 次，固液比为1:40(m/v)条件下，研究提取温度对叉枝鸦葱多糖提取率的影响，设计提取温度为50，60，70，80，90，100℃，实验结果如图5 所示。

由图5 可知，随着提取温度的增加，叉枝鸦葱多糖提取率呈现出先增加后减小的趋势，当提取温度增加到80℃时提取率达到最大值;提取温度继续增加时提取率则有所下降。因此叉枝鸦葱多糖的提取温度确定为80℃。

3.2 正交试验结果 采用L9(34)正交表进行实验设计，结合单因素试验结果，进一步考察固液比(A)、提取时间(B)、提取次数(C)、提取温度(D)对多糖提取率的影响。以多糖的提取率为考察指标，优选多糖提取工艺。用SAS 8.0 对正交结果进行方差分析，实验安排与结果见表1，表2 和表3。

表1 因素水平表

表2 正交试验结果与直观分析

表3 方差分析表

由表3 可知，在影响叉枝鸦葱水溶性多糖提取率的因素中，提取时间(B)和提取温度(D)对提取率有显著性影响，固液比(A)和提取次数(C)的影响不显著;由表2 可知，各因素对多糖提取率的影响程度从大到小依次为D ＞B ＞A ＞C，即提取温度＞提取时间＞固液比＞提取次数。在这4 个因素中，提取温度和提取时间对提取率的影响最大，固液比影响其次，提取次数影响最小。由此可以得出，水浴法提取叉枝鸦葱水溶性多糖的最佳工艺条件是:A1B2C2D2，即固液比为1 ﹕35，提取时间为1.5 h，提取次数为3 次，提取温度为80℃。

3.2.1 最佳提取条件验证

以正交试验的最佳提取条件进行验证试验，结果如表4。由表4 可知，多糖平均提取率为4.0495%，RSD=1.44%(n=4)，说明应用优化后的试验条件进行提取，多糖提取率较高，重复性较好。

表4 最佳提取条件验证(n=4)

4 结论

4.1 本研究采用传统中药材提取方法——水浴回流法提取叉枝鸦葱地上部分水溶性多糖，尽管多糖提取率偏低，但实验易于操作，成本较低，条件温和，保证了多糖结构的稳定性。

4.2 根据文献报道，以及作者对照品溶液和供试样品溶液的紫外－可见波长扫描结果显示二者在490 nm 处都有最大吸收峰，故用苯酚－硫酸比色法测定多糖含量，该方法简单、结果稳定可靠［7－9］。

4.3 采用正交试验法优化叉枝鸦葱水溶性多糖的提取工艺。结果表明最佳工艺条件为固液比为1 ﹕35，提取时间为1.5 h，提取次数为3 次，提取温度为80℃。该优化工艺可为其多糖的进一步分离纯化及其生物活性的评价奠定基础。

［1］中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志［M］.北京:科学出版社，1997.13－36.

［2］陶大勇，李树伟，任道泉，等.塔里木盆地叉枝鸦葱中鞣质含量的测定［J］.塔里木农垦大学学报，2004，16(4):5－8.

［3］陈英，陶大勇，蒋涛，等.四种沙漠植物生物碱的测定［J］.塔里木大学学报，2005，17(1):19－21.

［4］马国财，陈义磊，王小，强等.叉枝鸦葱黄酮类化合物提取工艺的研究［J］.光谱实验室，2011，28(1):286－290.

［5］Michel.Dubois，K.A.Gilles，J.K.Hamilton，et al.Colorimetric Method for Determination of Sugars and Related Substances［J］.Analytic Chemistry，1956，28(3):350－356.

［6］李云雁，胡传荣.试验设计与数据处理［M］.北京:化学工业出版社，2005:217.

［7］黄瑞松.中草药多糖含量测定方法概述［J］.中国药师，2005，8(1):68－70.

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