生物学试验中不同浸提条件下镍钛合金中镍溶出的研究

温贤涛，贺学英，李剑，汤菊莉，黄永富

北京市医疗器械检验所，北京市，101111

0 前言

医疗器械生物学试验中样品制备是生物学试验的第一步，是生物学试验成功开展的前提，是确保生物学试验结果真实可靠的保证。医疗器械生物学评价系列标准GB/T1688-12对样品制备条件进行了推荐，在生物学试验中常需要使用样品浸提液进行试验，即将试验样品浸入适宜的介质中，在一定的条件下进行浸提，然后使用浸提液进行一系列的生物学试验，其目的在于检测医疗器械可溶出物可能导致的生物学反应，以评价产品可能对病人或使用者的潜在危害。系列标准第12部分对浸提法原理进行了说明，并对浸提容器、浸提介质、浸提条件和方法等均进行了推荐，此方法主要参考药包材的浸提方法[1-4]。但由于医疗器械的材料、预期用途、使用方法等与药包材有很大区别，加上医疗器械本身的多样性，试验人员应该根据样品的物理化学特性等选择相应的浸提条件和方法。目前关于样品制备条件的研究国内外均开展得不多，可能是由于医疗器械生物学评价体系的建立相对较晚，加上医疗器械的多样性，医疗器械材料种类众多，物理化学性能相差很大，一一进行研究，时间成本和经济成本均太高。

本文以镍钛合金材料作为研究对象，进行不同浸提条件下镍溶出的比较研究。近三十年来，镍钛合金以其良好的生物相容性、形状记忆效应和超弹性等特点，已被广泛地应用于医疗器械领域[5]。但是由于镍钛合金中镍含量高，镍溶出是影响镍钛合金生物相容性的一个重要因素[6]。本研究选择两家医用镍钛合金生产厂家提供的镍钛合金丝，以生理盐水作为浸提介质，分别在GB/T 16886-12推荐的五种条件下进行浸提，采用等离子发射光谱仪（ICP）分析方法检测浸提液中镍浓度，比较不同浸提条件对镍溶出的影响，选择最优的浸提条件。同时，计算单位质量和单位面积下每天镍离子析出量，根据GB/T 16886.17推荐的过程[7]，与目前国际已知的镍毒性限量进行比较，评价镍钛合金的生物安全性。

1 材料与方法

1.1 材料

选用直径为2mm的镍钛合金(Ni/ Ti:55/45)，记材料编号为GM和JS，分别由供应商A和B提供。

1.2 试剂

生理盐水、蒸馏水、乙醇、多元素标准贮备液(100.0 μg/mL)。

1.3 仪器

iCAP6000等离子发射光谱仪、分析天平、超声清洗仪、烘箱。

1.4 方法

1.4.1 材料制备

镍钛合金丝截成10 mm，用自来水清洗三次，蒸馏水超声清洗5 min，再用乙醇清洗一次，最后蒸馏清洗三次，37oC烘箱中烘干，干燥器放置24 h以上备用。用10 ml玻璃瓶为容器，稀酸稀碱浸泡后，自来水和蒸馏水分别清洗三次后，37oC烘箱中烘干备用。

1.4.2 浸提

称取一定量的镍钛合金段放入玻璃瓶，按0.2 g/mL的浸提比例加入生理盐水，在不同浸提条件下进行浸提，每个浸提条件设三个平行样。浸提结束后，将镍钛合金取出，浸提液备用。

1.4.3 镍浓度分析

标准曲线绘制：用100 μg/mL 多元素标准贮备液配制成100 μg/L，200 μg/L 及300 μg/L 的标准液，上机绘制标准曲线。

浓度分析：进样管直接取浸提原液进行分析，结果取三个平行样的平均值。

2 结果与讨论

GM与JS镍钛合金在不同浸提条件下镍离子溶出浓度如表1、表2所示。

表1 GM镍钛合金在不同浸提条件下镍溶出情况Tab.1 The dissolution of nickel of GM nitinol under different extraction conditions

据表1、表2的镍溶出情况，可以得出以下实验结果。(1) 不同浸提条件下所制备浸提液中镍离子浓度不同。相同温度条件下，延长浸提时间，浸提液中镍离子浓度增加。相同浸提时间下，浸提温度越高，镍离子浓度增加。可见镍离子的溶出与浸提时间和温度成正相关。(121oC,1 h)浸提条件，虽然温度最高，但由于浸提时间很短，因此析出的离子较少。(50oC,72 h)及70oC,24 h)这两个浸提条件，溶出离子均明显高于(37oC,72 h)浸提条件下溶出的离子量，对于GM这种材料(70oC,24 h)溶出离子浓度近(37oC,72 h) 条件下的两倍。(2) 虽然不同浸提条件下GM和JS两种材料析出离子浓度的趋势是一样的，但同样浸提条件下析出离子量相差几百甚至上千倍。(3) 按WHO 1998年报告中数据，每人每天从食物获得的镍量为(86～406) μg，从水中获得的镍量为(5～25) μg[6]。例如用镍钛合金材料制备封堵器约0.5 g或冠脉支架约0.1 g，由于总质量和表面积小，按此实验得出的数据推算，可判断这类器械镍溶出在安全限量以内。

表2 JS镍钛合金在不同浸提条件下镍溶出情况Tab.2 The dissolution of nickel of JS nitinol under different extraction conditions

3 结论

本实验主要考查了不同浸提条件下镍钛合金材料镍溶出的情况，同时也比较了不同供应商提供的镍钛合金镍溶出情况。实验发现，16886.12中推荐的五种浸提条件对于镍钛合金材料没有等效性，其中(121oC,1 h)浸提条件下，镍离子溶出最少，建议今后镍钛合金材料的医疗器械产品生物学试验浸提液制备尽量不选择该浸提条件，以免不能充分浸提材料中的有害物质。镍溶出量受浸提时间和温度的共同影响，没有特殊情况时，常规浸提建议选择(37oC,72 h)浸提条件，因为该浸提温度最接近人体实际温度，更能模拟临床应用时的实际情况，72 h的浸提时间比24 h更为充分。(70oC,24 h)条件下离子浓度最高，此条件可作为加速或加严浸提时选择的浸提条件，可以缩短浸提时间，并且镍溶出量最高。此外，如果使用(70oC,24 h)条件制备的浸提液，在进行生物学评价时，可考虑按比例减少浸提液的用量，得到与(37oC,72 h)条件等效的结果。比如在开展慢（亚慢）性毒性试验，可减少浸提液的使用量，即减少样品用量，也尽可能考虑到动物福利的要求，减少每日给药量，减少动物痛苦。根据目前能查到的镍毒理数据，结合该实验中镍溶出量检测结果，可以基本确定镍钛合金材料是生物安全的，如果一种医疗器械设计时含有较大质量的镍钛合金材料，应该慎重。本实验数据均是在体外静态浸提条件下得到的，相比体内的生理环境较为简单，因此在对镍钛合金医疗器械进行风险评估时，应充分考虑体内复杂的生理环境，如各种无机离子、酶等蛋白质以及一些特定的生物力学环境等。因此应在下一步实验中开展体内试验，从全身毒性和局部反应等方面进行研究，特别是考察镍钛合金材料长期植入后的镍的代谢分布及对局部组织的影响。此外，该实验还发现即使同样是镍钛合金材料，供应商不同，产品的性能差别很大，镍溶出可以相差几百甚至上千倍。因此，建议医疗器械生产企业选择供货商时，根据预期产品性能要求及预期用途，对供应商进行充分评价。

[1]ISO 10993-12-2007 Biological evaluation of medical devices-Part 12:Sample preparation and reference materials [S].

[2]ISO 10993-1-2009 Biological evaluation of medical devices-Part 1:Evaluation and testing within a risk management process [S].

[3]GB/T 16886.1-2001 医疗器械生物学评价 第1部分:评价与试验[S].

[4]GB/T 16886.12-2005 医疗器械生物学评价 第12部分:样品制备与参照样品[S].

[5]郑玉峰,赵连城.生物医用镍钛合金[M].北京:科学出版社,2004.

[6]Mohammed ES,Martha ES,Helge FB.Assessing the biocompatibility of NiTi shape memory alloys used for medical applications[J].Anal Bioanal Chem,2005,381:557-567.

[7]GB/T 16886.17-2005 医疗器械生物学评价 第17部分:可沥滤物允许限量的建立[S].