高原环境影响药物代谢细胞色素P450酶活性的研究进展

郝 颖，王 荣，3，谢 华，孙玉环，3，李文斌，贾正平，3

(兰州大学1.生命科学学院，3.药学院，甘肃 兰州，730000;2.兰州军区兰州总医院全军高原损伤防治重点实验室，甘肃兰州 730050)

高原具有独特的环境特征，其中低氧和低压是影响人体正常生命活动的主要因素。随着高原医学和药理学的发展，高原疾病的防治工作，以及高原环境对药物代谢的影响等方面的研究已经取得了一定进展。但是，高原环境如何影响药物代谢，以及相关机制方面的研究仍处于探索阶段，本文对近年来高原环境对影响药物代谢的主要酶系—细胞色素P450(cytochrome P450，CYP)酶活性的研究现状做一综述。

1 高原环境的特殊性

高原是指海拔高度一般在1000 m以上、面积广大、地形开阔、周边以明显的陡坡为界以及比较完整的大面积隆起地区［1］。高原有其独特的环境特征，首先大气压低、含氧量和氧分压低。在平原地区，大气压为760 mmHg(1 mmHg=133.3 Pa)，氧分压为159 mmHg，氧分压大约占大气压的20.93%。当海拔达到3500 m时，大气压和氧分压分别下降到493 mmHg和103 mmHg，氧分压与平原地区相比降低了35%，而海拔达到4500 m时，氧分压降低40%(91 mmHg)。氧分压的降低使进入气管和肺泡的氧气减少，造成了机体各组织器官的缺氧［2］。其次，高原地区气候寒冷和紫外线强。这种特殊的环境因素容易引起人体一系列的不适反应，如头疼、气短、恶心、呼吸急促、心跳加快、呕吐和失眠等［3］。

近些年来，随着西北大开发、高原旅游业的兴起及高原突发事件的增加，使得高原活动日益频繁，高原急救、治疗及高原防护用药迫在眉睫，高原治疗用药逐渐成为医学和药学研究人员关注的重点，相关高原环境下的药物代谢研究逐渐被重视。另外，鉴于高原的特殊环境，关注高原居住人群的个体化用药，以及高原地区驻防和救灾官兵的用药成为药学工作者责无旁贷的任务。

2 与药物代谢相关的细胞色素P450酶

2.1 细胞色素P450酶的分类

在人体各个器官中，肝是药物代谢的主要器官。而在代谢药物中起关键作用的酶是位于肝微粒体的CYP酶系。该酶系是由一个庞大的基因家族编码调控的混合功能氧化酶系统。CYP酶因自身在还原状态下能与CO结合，在波长为450 nm处有一最大吸收峰而得名。CYP酶参与大部分药物和外源物的生物氧化，其中包括烷基的羟基化、烷基的环氧化、羟基的氧化、CYP氨部位上的羟基化和氧化等。涉及大多数药物代谢的酶系主要有CYPl，CYP2和CYP3 3个家族，相关的7种重要的亚基包括:CYP1A2， CYP2A6， CYP2B6， CYP2C， CYP2D6，CYP2E1和CYP3A，它们分别占 CYP总量的13%，4%，0.2%，20%，1% ～2%，7% 和30%［4］。各基因尚存在着大量等位基因，大量等位基因的存在是引起CYP药物氧化代谢个体差异和种族差异的生化基础［4-5］。其中CYP3A4是成人肝CYP中最重要的成分，大约50%的药物是通过CYP3A4代谢的。此外，该酶还参与了部分前致癌物质的活化，与之相关的药物相互作用亦十分多见。

2.2 细胞色素P450酶的检测方法

2.2.1 肝微粒体酶蛋白的制备与测定

肝微粒体酶蛋白的制备关键取决于酶活性不被降解。目前常用差速离心与超高速(105 000×g)离心沉淀联用的方法制备肝微粒体，并保证缓冲液接近生理状态。制备肝微粒体后，进行微粒体蛋白浓度和CYP含量的测定以便为CYP酶活性进一步研究提供可靠依据。目前常用于肝微粒体总蛋白浓度测定法有Folin-酚试剂法(Lowry法)、紫外吸收法、考马斯亮蓝法，还有近年来广为应用的BCA法;CYP酶含量的测定常用CO差示光谱法［6-8］。

2.2.2 细胞色素P450酶活性的检测方法

药物代谢是由具有催化活性的CYP酶进行的。目前，国外已将CYP及其相关亚型的测定列入新药的筛选及代谢研究的必须项目，但我国还处于探索阶段，尤其在高原等特殊环境下的对CYP酶与药物相互作用的研究还较少，所以应倡导该方面的研究，为高原药物的研发和筛选提供依据。

分析检测CYP酶活性的方法简述如下。

(1)基因分析法 即采用基因分型的方法直接测定特定的DNA变异来评价药物代谢酶［9］。CYP酶的遗传多样性是该方法的理论基础。Özdemir等［10］认为，CYP3A活性在个体之间的差异，其差异60%～90%是由于基因突变造成的。遗传多态性改变酶的表型可能导致药物代谢在不同个体间的差异。但是由于个体代谢酶基因的变异发生频率较低，而且很多变异是非特征性的且基因型检测费用高，只能定性不能定量等原因都限制了该方法的实际应用。

(2)免疫印迹法 蛋白免疫印迹法是分子生物学中常用的检测蛋白质表达活性的方法。Fradette等［11］用该方法比较了在中度缺氧和空白组中CYP亚型蛋白的表达活性。免疫印迹法需要制备各个亚型的蛋白单体和该蛋白单体的单克隆抗体。该方法只能定性或半定量地说明酶活性蛋白表达的变化，而不能定量说明酶活性的改变程度，可以作为检测P450酶活性的辅助方法。

(3)探针药物法(表1) 即某些经CYP代谢的药物，以其代谢物和原型药的比例或速率衡量代谢能力变化的方法。探针药物法直接考察了药物代谢的酶活性(表现型)，不仅考虑了基因而且还考虑了环境等其他因素对代谢酶活性的影响。但是，单一探针只能用于一种同工酶的测定，而且个体间变异较大。所以，为此“鸡尾酒”(Cocktail)探针药物法逐渐兴起来。该方法通过同时给予多种相对低剂量的探针药物，测定样本中每个探针药物的代谢率或产物的生成量等指标，以期获得多个代谢酶的表型信息［12］，“Cocktail”法最重要的优点在于可以在一次实验中完成多个代谢酶的评价，并且可以评价多种药物在体内的相互作用。如Schellens等［13］的研究中使用尼非地平、美芬妥英和司巴丁构成的“Cocktail”探针，结果发现，服用奎尼丁后司巴丁和尼非地平的代谢被明显地抑制，推断这种抑制作用主要是由于共同的药物代谢酶参与而引起的。

表1 细胞色素P450(CYP)酶主要亚型的常用探针药物及其代谢产物

探针药物法的有效应用需要借助高通量和精确的分析手段，目前常用的是高效液相色谱-质谱联用(high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLCMS/MS)等方法检测哺乳动物探针药物在血清中的代谢率或清除率。王丹等［14］用HPLC-MS/MS的方法同时测定了6种探针药物的代谢率并建立了快速评价CYP同工酶活性的方法。HPLC-MS/MS方法稳定，具有较高的灵敏度和分辨率，在探针药物的检测方面具有很大的应用潜力。

3 高原环境对细胞色素P450酶系的影响

3.1 急性缺氧对肝生物转化外源物能力的影响

目前已有多种方法考察了急性缺氧对肝生物转化外源物能力的影响。当动脉血氧分压(arterial partial pressure of oxygen，PaO2)降低时，大鼠肝中环己巴比妥代谢率下降。PaO2的急性降低造成了环己巴比妥代谢的急剧减少，相当于吸入一氧化碳后血红蛋白脱饱和。小鼠连续5 d暴露在5500 m的高海拔环境下，脑中的环己烯巴比妥水平和环己巴比妥睡眠时间减少。这些动物表现出微粒体部分催化能力的增加，氯苯唑胺(zoxazolamine)和巴比妥的在体研究也得出类似的结果［15］。相反，模拟5500 m海拔高原低氧环境，饲养大鼠3个月，其CYP的总量减少，肝组织匀浆的抗氧化酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶同样减少［16］。这些实验表明，缺氧改变了一些外源性物质的动力学，但没有给出足够证据说明其改变的原因。

3.2 缺氧环境下通过细胞色素P450酶催化的药物代谢动力学的变化

近期研究通过动物体内模型阐明血氧不足对CYP活性的影响。将家兔置于低浓度氧环境中9.5 h，使PaO2稳定于50 mmHg附近，茶碱的清除率从 1.57±0.05下降到(1.16 ±0.09)ml·min-1·kg-1(P ＜0.05)。有趣的是，高碳酸血症酸中毒(PaCO2≈57 mmHg，pH≈7.25)使茶碱的清除率降低为(1.21 ±0.12)ml·min-1·kg-1，但代谢性酸中毒(pH≈7.26)没有这种现象。低氧血症和高碳酸血症结合可进一步降低茶碱的清除率达到(1.13 ±0.05)ml·min-1·kg-1。大鼠间歇性缺氧也降低了茶碱的清除率［17］。

在体实验中，以呼吸室内空气的家兔作为对照组，急性中度低氧血症〔PaO2=(51±1)mmHg〕，高碳酸血症〔PaCO2=(68±1)mmHg〕，或低氧血症和高碳酸血症相结合〔PaO2=(53±1)和PaCO2=(61±1)mmHg〕组没有改变注射利多卡因的清除率。此外，清醒的比格犬在8%FiO2的环境中生存6 d，保持PaO2为45 mmHg，虽然引起血浆中单乙基甘油二甲基苯胺和甘氨酸二甲代苯胺浓度增加，但利多卡因的清除率没有改变。利多卡因通过CYP3A4，CYP1A2，和CYP2C9进行N-脱乙基形成单乙基甘油二甲基苯胺，3-羟基化生成3-OH-利多卡因催化几乎完全由CYP1A2完成，CYP3A4只有极少部分参与［18-19］。

3.3 缺氧环境对细胞色素CYP450酶活性的影响

用家兔进行在体实验，评价急性中度低氧血症(PaO2=48 mmHg)，高碳酸血症(PaCO2=65 mmHg)或低氧血症和高碳酸血症相结合(PaO2=51 mmHg和PaCO2=72 mmHg)对苯妥英动力学的影响。虽然其他实验条件并没有改变苯妥英药代动力学，但低氧血症使苯妥英的清除率减少了50%［20］。苯妥英的生物转化主要由CYP2C9和较少部分的CYP2C19 催化［21］。

家兔急性中度缺氧(PaO2=50 mmHg)减少了丙泊酚(异丙酚)的清除率。值得注意的是，在离体实验中，低氧血症影响肝组织匀浆中丙泊酚的生物转化，但在肺组织匀浆中没有影响［22］。丙泊酚生物转化的主要途径是经尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸转移酶LA9亚型转化成葡萄糖醛酸。丙泊酚也会由一些CYP亚型催化进行环羟基化反应，例如:CYP2B6催化生成 4-羟基-异丙酚的能力类似于 CYP2C9，比 CYP1A2、CYP2A6、CYP2C19、CYP2D6和 CYP3A4的催化能力大 4至10 倍［23-24］。

目前关于高原环境的动物实验主要是在高压氧舱中模拟高原缺氧的条件下进行的。Proulx等［25］在1995年报道了家兔急性缺氧8 h后，CYP酶的含量降低而CYP酶的活性没有变化，24 h后酶的含量和活性都降低，提示高原低氧环境可能降低CYP酶的代谢活性，但是与时间有关，在较短时间内酶的活性没有明显变化可能因为动物体内存在代偿性反应。在高海拔慢性缺氧状态下，CYP2C9和CYP2C19的蛋白表达无影响，而高海拔急性缺氧使CYP2C19活性显著升高［26］。在中度缺氧的条件下，雄兔肝微粒体酶的代谢活性也发生改变。实验表明，CYP1A1、CYP1A2、CYP2B4、CYP2C5和CYP2C16的活性降低，CYP3A6的活性增强。由于肝CYP酶对药物进行生物转化是一个耗氧的过程，所以，有研究人员推断在缺氧期间，肝代谢转化药物的能力是受到抑制。动物实验结果显示，缺氧对CYP酶的催化活性和水平结果有争议。有些研究表明降低活性，而有些报道称增加或保持不变，甚至一些其他动物实验显示了双向结果，提示对CYP酶的影响依赖于缺氧时间或缺氧程度。2002年，Jürgens等［27］第一次做了关于高原对药物介导的CYP酶活性的影响的人体试验，通过高效液相色谱法测定探针药物的清除率考察了人体重要的几种CYP酶亚型。其中CYP2D6和CYP3A4的活性稍有减少，回到平原后活性升高，而CYP1A2和CYP2C19可能有所增加，但变化无统计学意义。2009年，李向阳等［28-29］报道了有关中国人急进高原的药代动力学，由平原急进高原(3780 m)的志愿者和常驻高原的志愿者之间磺胺甲噁唑的药代动力学有明显差异。磺胺甲噁唑是CYP2C8的探针药物，可以为CYP2C8活性的研究提供参考。De Bock等［30］首次在体外将探针药物与大鼠肝微粒体细胞共孵育，并用 HPLC-MS/MS的方法定量检测了CYP1A2、CYP2D6、CYP2E1 和 CYP2C9 的活性:0.25 g·L-1的微粒体蛋白，孵育15 min后，CYP1A2、CYP2E1和CYP2C9的催化活性分别为776.22，1290.18，725.59 和 381.48 nmol·g-1·min-1。

综合考虑，动物研究表明，急性中度缺氧(PaO2≈45 mmHg)通过 CYP1A、CYP2A、CYP2B、CYP2C 和 CYP2E亚型对外源性化学物质的生物转化清除率产生影响。外源性化学物质生物转化主要由CYP2D和CYP3A催化可能不会受到缺氧影响。人体试验观察到，实验性低氧血症中葡萄糖醛酸基转移酶，磺基转移酶和N-乙酰基转移酶的活性不会降低。

3.4 高原环境对P450酶的调节作用的机制

对于高原环境对CYP酶的调节作用的机制研究，现在还处于探索阶段，尚无明确的根据。有报道称［31］血浆介质中对 CYP亚基起下调作用的是干扰素-γ，白细胞介素(interleukin，IL)-1β和IL-2。促红细胞生成素也参与增加CYP酶的活性和增强CYP3A4的表达。低氧诱导因子-1是目前研究较多的关于高原低氧的细胞调节因子。低氧诱导因子-1作为低氧应答时基因表达和恢复细胞内环境稳定的凋节中心，可以稳定地表达并调控一系列低氧相关基因，低氧诱导因子-1可以与 CYP3A6的启动子结合，反式激活CYP3A6的基因并诱导基因表达［32］。胎儿在母体内类似于缺氧环境，有研究证明，低氧诱导因子-1α在胎儿体内对CYP3A基因的表达机制与成年人不同［33］。目前，已知的高原低氧适应人群有3类:① 南美安第斯山的印第安人;②喜马拉雅山的藏族人;③非洲埃塞俄比亚人。我国科学家与国外研究机构联合对世居藏族人群的基因组进行测序。结果表明，藏族人群存在高原适应相关的候选基因。该研究成果在基因水平上阐明了人体在高原环境长期适应过程中的调控结果，其中有关CYP17A1及CYP2E1等与CYP酶的相关基因的适应性突变可能成为藏族人群对高原环境适应性的基因凭证［34-35］。但相关基因单核苷酸多态性的改变与基因表达的联系，以及表达调控的机制研究尚不多见，尤其是突变基因的表达是否会对药物代谢的相关酶系产生影响未见报道，具有较大的研究空间。

4 展望

20世纪70年代以后，高原医学和药理学开始发展起来，前期主要集中在高原反应和高原疾病起因的描述，随着对高原环境的了解加深，高原低氧对药物代谢的影响等方面的研究逐渐展开。虽然在高原CYP和代谢机制方面的研究取得了一定的进展，但仍有着很大的研究前景:①前期的研究主要集中在大鼠、家兔等哺乳动物在低压氧舱下的模拟实验，而动物与人的药物代谢仍有较大区别，低压氧舱也缺乏考虑高原寒冷、辐射、昼夜温差大等自然环境因素，近些年来人们已经开始重视以世居高原人群和急进高原人群作为研究对象，但仍缺乏有力实验支持。② 目前酶活性的检测方法多采用高效液相色谱和质谱联用等，定量考察探针药物经过某种酶代谢后的代谢产物，但该法对仪器水平要求较高，有文献报道可以采用多种CYP酶特异性底物与微粒体蛋白共孵育的方法同时检测多个底物的代谢产物，该方法虽然条件并不完善，但简单，可靠，具有较好的推广价值。③ 前期的研究工作主要集中在生理学和药理学水平上，综合细胞生物学和分子生物学的发展，可以在细胞传导和基因调控水平上，深入探讨CYP酶在高原环境下的代谢机制。

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