BNP在不同缓冲体系中的血管舒张功能评价

高 昊， 刘利平， 马 鑫， 陈 蕴， 金 坚

（江南大学 药学院，江苏 无锡 214122）

BNP作为心脏分泌的利尿钠肽家族的一员，起初是从猪脑中被提取纯化的[1]。内源性人BNP是一种主要由心室肌分泌的循环多肽，其分泌水平与心室内容量和压力负荷状态相关[2]。心脏在功能受损时分泌BNP，起到对抗性调节激素作用，即通过与RAAS内皮质素-1和SNS等生理性拮抗和抑制作用来维持心功能与体液平衡[3]。随着心脏功能的进一步恶化，血管神经激素系统和保钠潴水激素系统的过度激活，机体陷入循环系统病理生理紊乱，最终掩盖了内源性BNP心脏保护的代偿作用[4]。适时给予外源性BNP，使其血浆浓度增加2～6倍，可迅速改善急性失代偿患者血流动力学、神经激素水平和临床体征，降低患者的死亡率[5]。

重组人脑钠肽 （recombinant human brain natriuretic peptide，rhBNP）注射液已先后被美国FDA和中国SFDA批准上市，用于急性失代偿性心衰的治疗，其临床治疗方式为静注，疗程在2周以上。经过10余年的临床应用，The Connor Group等机构通过欧美多个医学中心的6 000多个治疗病例，分析发现FDA批准上市的奈西立肽（重组人脑钠肽商品名）治疗心衰患者后，其死亡率和再住院率没有明显的改善，却与患者中低血压病例的数量增长有直接的联系，因此Connor等机构不推荐奈西立肽作为心衰病人的一线治疗药物[6]。在国内，作者在与一些心血管医师的沟通中也获得该类药物存在疗效不稳定的缺陷。从FDA公布的资料来看，BNP类药物是一类有效的血管扩张剂，但利尿作用不明显，且成药性研究也与临床应用结果差距颇大。作者推测其问题可能主要存在两个方面：第一，rhBNP因原核表达除了产物完整性的因素外，缺乏对其有效二级结构进行必要的构象限定；第二，生产厂家在制剂制备过程中未对rhBNP进行系统的微环境研究，导致高活性rhBNP的二级结构不稳定。作者以化学合成获得的完整BNP为研究对象，通过设计不同的缓冲体系来提高和稳定BNP的活性，为开展更有效的BNP注射剂配方研究打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

BNP （氨基酸序列：SPKMVQGSGCFGRKMDRI SSSSGLGCKVLRRH），由上海生工生物工程有限公司合成，纯度＞99%，未对其第10位和26位的Cys进行氧化形成链内二硫键。新活素（冻干重组人脑利钠肽），为成都诺迪康生物制药有限公司产品（国药准字S20050033），其注射剂组成为0.5 mg重组人脑利钠肽、8 mg 甘露醇、1.73 mg Na2HPO4、0.93 mg NaH2PO4、9 mg NaCl。去氧肾上腺素，系阿拉丁产品。其他试剂均为国产分析纯，购自于国药集团化学试剂有限公司。

Krebs溶液的配制：NaCl 9.0 g、 KCl 0.42 g、CaCL20.24 g、NaHCO30.1～0.3 g、 葡萄糖 1.0～2.5 g（1 000 mL），葡萄糖在使用前加入。

新西兰家兔，体质量2～2.5 kg，雌雄不限，由江苏省血吸虫防治研究所实验动物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 离体血管的灌流实验 家兔耳缘静脉空气推注处死后，取其胸主动脉，在预冷的氧饱和Krebs液中分离结缔组织，制成系列3～4 mm长的血管片段，每个实验所用的血管条数均为6。将兔胸主动脉血管片段于37℃通氧条件下悬吊入含4 mL Krebs溶液的平滑肌浴漕中，接张力换能器到生物机能实验系统（改良型血管、胃肠和子宫等离体灌流实验系统，medease改良型，南京美易科技有限公司），记录血管张力的变化。初始张力定位2.5 g，经6 μmol/L KCl溶液灌洗和去KCl溶液平衡20 min后，给予6 μmol/L的去氧肾上腺素作为预刺激。待收缩张力稳定后，再给予10-8～10-5mol/L BNP观察血管片段张力变化。以新活素的纯水溶液作为阳性对照，逐步增加以制成累计浓度—舒张反应曲线，待药物浓度达到10-5mol/L时，停止加药并记录舒张反应。详见文献[7]。

1.2.2 pH梯度缓冲液的配备 考察pH分别为4、5、6、7、8（偏差±0.2），缓冲液体系分别为醋酸/醋酸钠（醋酸盐）、磷酸氢二钾/磷酸二氢钾（磷酸盐）和柠檬酸/磷酸氢二钠 （柠檬酸盐）3种体系下BNP的活性表现。按表1所列浓度配置母液，然后按表2的比例制备缓冲液。各缓冲液的pH均在其缓冲范围内[8]，如表 3所列。

1.2.3 斑马鱼体内试验 取数尾斑马鱼幼鱼置于六孔板中，加入3 mL鱼水，再加入的特非那定溶液至一定浓度，诱导一定时间后，移除诱导剂，用鱼水清洗3次，在显微镜下挑选静脉淤血明显的斑马鱼进行注射。用微量加样枪头吸取3 μL待测药液，推注入显微注射针中，将针装入注射柄中，调节压力和注射时间使注射量为10 nL。随后将挑选的斑马鱼幼鱼置于含160 μg/mL的MS222（间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐，鱼用麻醉药）的鱼水中，麻醉至无触碰反应后，对其进行静脉注射，注射结束后用正常鱼水进行清洗，直至复苏，放置28℃培养箱进行孵育。在给药后2 h，针对斑马鱼的心脏及静脉淤血部位进行照相，观察淤血有无消除。

表1 母液的制备Table 1 Preparation of mother solution

表2 缓冲液的制备Table 2 Preparation of buffer

表3 缓冲容量Table 3 Buffer capacity mol/L

2 结果与讨论

2.1 重组BNP醋酸/醋酸钠缓冲溶液对离体血管的影响

将药物对数浓度和舒张率的数据收集并绘制累计浓度—舒张反应曲线，计算各个pH条件下BNP的EC50和95%可信区间，并与阳性药物做统计分析。如图1和表4所示，BNP在pH为4和5的醋酸/醋酸钠条件下，均对血管具有显著的舒张效应，且在pH=5醋酸/醋酸钠缓冲液条件下，BNP舒张兔胸主动脉血管片段作用的最适浓度为10-7mol/L。而pH=6的BNP缓冲溶液与阳性对照组相比没有显著性差异（P＞0.05）。在实验观察的干预药物浓度内均优于pH=6的溶液条件，暗示接近生理pH的醋酸溶液对BNP活性保持有利。EC50的提高，则说明酸性条件下有利于稳定BNP的活性。

图1 BNP的醋酸/醋酸钠缓冲溶液与家兔离体血管舒张效应的剂量关系Fig.1 Relationship between BNP in HAc/NaAc buffer concentration and relaxation effects on isolated vascular

表4 醋酸/醋酸钠缓冲液的EC50及其95%可信区间Table 4 EC50 and 95%Confidence Intervals of 醋 酸/醋酸钠buffer

2.2 重组BNP磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲溶液对离体血管的影响

从图2和表5可知，在pH为6和7的磷酸盐缓冲条件下，BNP均能明显表现出舒张兔胸主动脉血管环的作用；而当pH=8时，BNP则失去活性。与pH=6时的舒张血管效果不同，pH=7时舒张血管没有剂量依赖关系，但作用浓度范围明显加宽，效果稳定性提高。与图1中的醋酸/醋酸钠缓冲溶液相比较，BNP在近中性的生理条件下能保持较高的生物活性是磷酸盐缓冲条件的显著优势。

图2 BNP的磷酸氢二钾/磷酸二氢钾缓冲溶液与家兔离体血管舒张效应的剂量关系Fig.2 Relationship between BNP in K2HPO4/KH2PO4 buffer concentration and relaxation effects oon isolated vascular

表5 磷酸氢二钾/磷酸二氢钾缓冲液的EC50及其95%可信区间Table 5 EC50 and 95%Confidence Intervals of K2HPO4/KH2PO4buffer

2.3 重组BNP柠檬酸/磷酸氢二钠缓冲液对离体血管的影响

由图3和表6分析得知，BNP在柠檬酸缓冲条件下活性与剂量依赖关系更明确。当pH为4～6时，实验高浓度BNP的柠檬酸缓冲溶液对兔胸主动脉血管片段不仅表现出了更好的舒张效果 （50%vs 100%，50%vs 100%）， 而且在 10-8～10-5mol/L 浓度区间内呈良好的剂量依赖性，因而BNP在这个条件下会有更佳的安全性和更高的活性。

图3 BNP的Citric acid/Na2HPO4缓冲溶液与家兔离体血管舒张效应的剂量关系Fig.3 Relationship between BNP in Citric acid/Na2HPO4 buffer concentration and relaxation effectson isolated vascular

表6 柠檬酸/磷酸二氢钾缓冲液的EC50及其95%可信区间Table 6 EC50 and 95%Confidence Intervals of Citric acid/Na2HPO4buffer

2.4 斑马鱼体内试验

虽然离体血管灌流实验能够有效地观察到BNP在不同缓冲溶液中的活性，但是体外试验的局限性并不能够了解BNP对于心脏的作用，因此随后委托杭州环特生物有限公司在斑马鱼上做体内试验来评价BNP在不同缓冲体系的体内活性。

2.4.1 给药前处理 挑选生长发育完整的斑马鱼成体，使用特非那定在斑马鱼模型上制造心衰淤血模型，如图4所示斑马鱼给药后患有心包水肿，同时伴有淤血。

图4 斑马鱼模型Fig.4 Zebra fish model

2.4.2 给药注射观察 分别给斑马鱼心衰模型注射空白缓冲液和BNP缓冲液，pH值分别为4和5，注射后的心脏形态如图5和图6。根据图5和图6能够发现：BNP在pH=4和pH=5的柠檬酸缓冲液体系中对心脏具有良好的活性和疗效。两者都有效地改善了斑马鱼的心包水肿症状并消除了显著淤血。并且BNP在pH=4的条件下其消除淤血的能力比pH=5的条件下要强，而这也与家兔离体血管实验中对于血管舒张的结果相吻合。

图5 pH=4.0的BNP缓冲液对模型的影响Fig.5 Effect of BNP in pH=4.0 buffer in zebra fish model

图6 pH=5.0的BNP缓冲液对模型的影响Fig.6 Effect of BNP in pH=5.0 buffer in zebra fish model

2.5 讨论

BNP等多肽药物的共性需要有效二级结构的构象限定才能保持活性[9]，本实验中虽然不同缓冲条件的BNP溶液在离体兔胸主动脉血管片段上都表现出了一定的舒张作用，但差异性很大，更加值得重视的是在实验设计的条件下，对照药物都未获得有效的结果，也进一步证明微环境研究对不稳定的多肽药物二级结构的重要性。实验结果显示，偏酸的多数缓冲条件均利于BNP活性的保持，偏碱则反之。在微偏酸的醋酸/醋酸钠缓冲液条件下，BNP活性保持的效果明显，表现为有效浓度下降，但活性保持与剂量关系复杂，高剂量频繁出现舒张不应、反而收缩的表象降低了该缓冲体系的适用性。

已上市的BNP药物采用的磷酸盐缓冲条件，在近中性的生理条件下可保持较高的BNP生物活性，这是其作为制剂缓冲条件的优势。虽然BNP的作用稳定性在磷酸盐缓冲条件下得以明显提高，但舒张血管作用的非剂量依赖关系，对于外源给予BNP改善急性失代偿性心衰的症状不利，是否是Connor等机构观察发现rhBNP对治疗指数无效性的原因之一，尚需进一步补充证明。与对照药物相比，BNP在微偏酸的柠檬酸溶液中的离体兔胸主动脉血管片段舒张率提高了4倍（100%vs 20%），且呈现了良好的药物剂量依赖效应，因此柠檬酸缓冲液作为BNP注射剂的基质是确实可行的。急性失代偿性心衰症状缓解的治疗关键是 “强心、扩血管和利尿”[10]，明确柠檬酸缓冲条件下BNP舒张血管的剂量依赖关系，对于临床治疗制剂的设计有利，pH 5或6的柠檬酸缓冲液具有作为改进BNP注射剂处方的潜在价值。

3 结语

在相同的缓冲体系条件下，BNP的活性随pH值而变化，其在酸性环境下的活性明显好于中性和碱性条件下的活性，推测这是因为BNP在酸性条件下的结构特征能够更好地与血管上的作用受体相结合。虽然在酸性环境下BNP都表现出了活性，但在同一pH条件下，不同缓冲体系间的活性差异也极其显著，它表明BNP在特定缓冲体系条件下所形成的构象对于其受体也具有更高的活性。这也意味着一些看似结构简单的多肽类药物也与大分子蛋白质相类似，必须有着正确的折叠结构才会表现出更高的活性和稳定性，而这却是以往实验中常常被忽略的现象。同时也意味着在多肽类药物的生产过程中，重组表达方法并不能生产出合格的多肽类药物产品，其外在环境对多肽活性的影响也是需要考虑的，还提示化学合成的多肽原料药需要进行优化折叠和折叠后构象限定的工艺研究。

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