锈叶杜鹃授粉花柱的显微观察与自交亲和性分析

解玮佳，白 天，李世峰* ，关文灵，宋 杰，彭绿春，李树发，蔡艳飞，陆 琳

(1.云南省农业科学院 花卉研究所，云南 昆明 650205;2.云南省花卉育种重点实验室，云南 昆明 650205;3.云南省花卉工程中心，云南 昆明 650205;4.云南农业大学 园林园艺学院，云南 昆明 650201)

锈叶杜鹃(Rhododendron siderophyllum)为杜鹃属(Rhododendron)杜鹃亚属(Subgen.Rhododendron)杜鹃组(Sect.Rhododendron)三花杜鹃亚组(Subsect.Triflora)植物［1］，其具有花期早，移栽成活率高等特点［2］，是选育早花杜鹃品种的优良种质资源。作为育种材料，了解其自交亲和性和自花授粉结实率等生殖生物学特性，对于杂交育种工作的顺利进行至关重要。近年来，利用胼胝质荧光反应观察榛子(Corylus avellana)［3］、苹果(Malus pumila)［4］等植物的花粉和雌蕊相互作用以检测其自交亲和性的研究已有报道，而在杜鹃花上尚未有相关研究。本实验采用苯胺蓝荧光显微技术对锈叶杜鹃自交授粉后花粉在其花柱中的生长过程进行观察，对其自交亲和性进行鉴定，旨在为今后开展锈叶杜鹃的杂交育种工作奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

试验材料来自位于昆明阿子营乡N 25°23'、E 102°73'，海拔2 240～2 270 m地带的锈叶杜鹃自然居群。

1.2 试验方法

1.2.1 自花授粉 2012年3月8日—9月17日，选取生长健壮的植株，在松蕾期去雄，然后套硫酸纸袋隔离，并将不同植株上摘下的花药分别收集在不同的干净硫酸纸袋中，做好标记，带回室内，置于通风处阴干，待花粉散出后，带回野外进行同株自交授粉，授粉后再套硫酸纸袋隔离。授粉花朵数不低于150朵花。

1.2.2 荧光显微镜观察 花柱压片参照Williams等［7］的方法，分别取自花、异花授粉后2，4，8，12，24，48，76 h雌蕊放入 FAA 固定液(V(甲醛)∶V(冰醋酸)∶V(70%乙醇)=1∶1∶18)中固定4 h，随后转入体积分数70%的酒精中，4℃冰箱中保存备用。压片前，将固定后雌蕊用蒸馏水冲洗至无色，放入4 mol/L NaOH溶液中60℃软化2 h，用蒸馏水冲洗至无色，用0.1%水溶性苯胺蓝染色48 h。纵向剖取1/2雌蕊及子房，将材料放置于载玻片中央，吸水并滴加1～2滴甘油，盖上盖玻片在荧光显微镜下观察。在Leica荧光显微镜观察下观察花粉萌发、花粉管生长及受精情况。每张切片取3个视野统计花粉管萌发率，测量花粉管长度。每处理观察15朵花。

1.2.3 坐果率 以田间套袋杂交授粉的方式处理不少于50朵花，待花柱枯萎后去袋，授粉后3周统计果实膨大率，授粉后3个月统计结实率。

1.2.4 数据处理 试验数据经SPSS16.0统计软件处理，分析差异显著性。

2 结果与分析

2.1 锈叶杜鹃自花授粉柱头上花粉萌发及花粉管生长的荧光显微镜观察

从锈叶杜鹃自花授粉后花粉萌发和花粉管生长的荧光显微镜观察来看，授粉后2 h锈叶杜鹃的花粉开始在柱头上萌发，花粉管伸长，并缠结在柱头乳突细胞周围，以此同时，锈叶杜鹃的柱头乳突组织上出现了大量的胼胝质沉积(图1，1);授粉后4 h，锈叶杜鹃的花粉大量萌发(图1，2);授粉后8 h，花粉管进入花柱组织，花粉管中出现大量胼胝质(图1，3)，授粉后12 h，部分花粉管在花柱组织中发生异常缠绕现象(图1，4);授粉后24 h，锈叶杜鹃的花柱通道组织中出现大量胼胝质沉积(图1，5)，花粉管出现大量胼胝质塞(图1，6)和不规则胼胝质沉积(图1，7);授粉48 h后，花粉管进入子房，子房引导组织出现大量胼胝质沉积(图1，8)，部分花粉管出现粗细不均现象(图1，9);授粉后76 h，胚珠内出现多处胼胝质的异常沉积(图1，10)，花粉管进入胚珠(图1，11)，部分花粉管在进入珠孔时发生逆向生长(图1，12)。

Fig.1 锈叶杜鹃自花授粉的花粉萌发，花粉管生长及受精情况Fig.1 Pollens germination，growth and fertilization in Rhododendron siderophyllum self-cross

2.2 锈叶杜鹃自花授粉的花粉管生长速度

从花粉管的生长速度来看(图2)，锈叶杜鹃自花授粉的花粉管平均生长速度为4.39 μm/min，生长速度呈先快后慢趋势，在授粉后2～12 h这一时段内生长较快，而在授粉后12～76 h生长较为缓慢。

从授粉后不同时间花粉管到达的位置来看(表1)，在授粉后2～8 h的时间段内，花粉管均处于花柱上部，而在授粉后12 h，花粉管到达花柱中部，授粉后24～48 h，花粉管伸长至花柱下部，直至授粉后76 h，花粉管才进入子房。

从实验结果来看，锈叶杜鹃自花授粉后花粉管在授粉后的2～12 h内在花柱上部迅速生长，而在此后的64 h内，在花柱中下部缓慢生长，最终到达子房。

图2 锈叶杜鹃自花授粉后不同时间的花粉管生长情况Fig.2 Pollen-tube growth in the different time after self-cross of Rhododendron siderophyllum

2.3 锈叶杜鹃自花授粉坐果率

对锈叶杜鹃161朵花进行自花授粉，仅有32朵结实，坐果率为19.89%，从结果可以看出，锈叶杜鹃能接受自身花粉并坐果，表现为自交亲和性。

表1 锈叶杜鹃自花授粉的花粉管生长情况Tab.1 Pollen germination，pollen-tube growth of Rhododendron siderophyllum after self-cross

3 结论与讨论

本实验表明，锈叶杜鹃自花授粉中花粉能够在柱头上正常萌发，花粉管能够在花柱通道内顺利生长，且在76 h内可以到达子房，完成受精，荧光显微观察的结果说明锈叶杜鹃自交亲和。而锈叶杜鹃的田间自花授粉坐果率为19.89%，实际验证了锈叶杜鹃的自交亲和性。但是，在荧光显微观察中发现，锈叶杜鹃的柱头在自花授粉后2 h就出现了乳突细胞的胼胝质反应，说明锈叶杜鹃在自交过程中仍然存在排斥现象。与此同时，在锈叶杜鹃的花粉管生长过程中，从柱头乳突细胞开始到花粉管、花柱通道细胞、子房引导组织、胚珠的胚囊等都伴随出现一系列的胼胝质反应。Williams等［5］研究认为，杜鹃花种间杂交不亲和障碍有7类，即花粉萌发失败;花粉管在柱头表面发生异常;花粉管在花柱引导组织内发生异常;花粉管无法达到子房;花粉管无法进入珠孔;花粉管无法进入胚囊及花粉管无法释放精细胞至胚囊。本实验中观察到锈叶杜鹃自花授粉后，其花粉管生长过程中出现花粉管在花柱引导组织内缠绕、粗细不均，花粉管无法进入珠孔等几种异常，实验表明在锈叶杜鹃自身存在多处屏障来阻碍其自交花粉管的生长，以此抑制其自交亲和。锈叶杜鹃自交过程中，授粉后的12～76 h花粉管的生长速度明显慢于授粉初期，这与王浩等［4］、李天忠等［6］观察到的苹果自花授粉花粉管生长到花柱中部之前被抑制的研究结果不一致，说明锈叶杜鹃抑制其自交的过程主要发生在授粉后期。Williams等［7］认为绝大部分的杜鹃花完全自交亲和，少数种类自交少结实或不结实是由合子胚败育引起。从本次试验结果来看，锈叶杜鹃自交过程中花粉萌发和花粉管生长基本正常，胚珠受精率达44.8%(未发表数据)，远高于锈叶杜鹃的田间坐果率19.89%，而这是否与合子胚败育有关还需今后做石蜡切片进一步研究。

本次试验结果证明，锈叶杜鹃具有自交亲和特性，在杂交育种中作为杂交亲本材料必须及时进行去雄套袋处理，以避免出现自交结实而影响杂交育种工作的顺利进行。

［1］中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志第57卷第一册［M］.科学出版社，1992:81.

［2］龙秀琴，高贵龙，李苇洁，等.杜鹃花期早晚种配置延长观赏期的研究［J］.湖北农业科学，2011，(50)2:310-327.

［3］Mehlenbacher，Thompson.Dominance relationships among S-alleles in Corylus avellana［J］.Theor Appl Genet，1988(76):669-672.

［4］王浩，刘国成，吕德国，等.寒富苹果授粉花柱的荧光显微观察与自交亲和性分析［J］.果树学报，2008，25(2):162-165.

［5］Williams E G，Knox R B，Rouse J L.Pollination subsystems distinguished by pollen tube arrest after incompatible interspecific crosses in Rhododendron［J］.Journal of Cell Science，1982，53，255-277.

［6］李天忠，奥野智旦.苹果自花授粉的花粉管结果变化及S-RNase定位［J］.园艺学报，2005，32(2):295-297.

［7］Williams E G，Rouse J L，Palser B F，et al.Reproductive biology of Rhododendron［J］.Horticultural Reviews 1990，12:13.

［8］解玮佳，李世峰，李树发，等.高山杜鹃与大喇叭杜鹃种间杂交过程的观察研究［J］.西北植物学报，2012，32(12):2432-2437.

［9］毕晓颖，娄琦，郑洋.马阑与溪荪种间杂交亲和性研究［J］.园艺学报，2011，38(5):977-984.

［10］徐雁飞，陈发棣，滕年军，等.菊花品种自交亲和性鉴定及其授粉后花柱内3种保护酶活性的变化［J］.园艺学报，2009，36(1):59-64.

［11］齐国辉，徐继忠，黄瑞虹.自花结实鸭梨授粉受精过程中生理代谢变化规律研究［J］.河北农业大学学报，2011，34(1):42-46.

［12］于晓艳，赵兰勇，丰震，等.22份国产玫瑰资源的自交亲和性［J］.中国农业科学，2009，42(9):3236-3242.

［13］陈君，王霞，徐荣，等.肉苁蓉花粉原位萌发与自交不亲和性初步研究［J］.中国药学杂志，2011，46(14):1066-1069.

［14］孙春青，陈发棣，房伟民，等.甘菊与栽培菊‘金陵黄玉’种间杂交失败的原因［J］.园艺学报，2009，36(9):1333-1338.

［15］蔡明，孟锐，潘会堂，等.紫薇属与散沫花属远缘杂交亲和性的研究［J］.园艺学报，2010，37(4):637-642.