点带石斑鱼鱼皮和鳞片胶原蛋白的提取及理化性质的研究

黄亚冬，邢克智，刘海学，王金娥，陈成勋，王庆奎

（天津农学院a.水产科学系，b.天津市水产生态及养殖重点实验室，c.农业分析测试中心，天津 300384）

胶原蛋白（collagen）是生物体内广泛存在的一种重要蛋白质，也是结缔组织的主要蛋白成分.与来源于陆生哺乳动物的胶原蛋白相比，水产动物原料通常具有高蛋白、低脂肪的特点，能够避免动物性传染病的传播，安全性好，非常适宜于制备胶原产品[1].近年来以水产动物为原料制备的胶原蛋白产品被世界公认为一种安全性较高的胶原蛋白来源，备受国内外消费市场的青睐.

点带石斑鱼（Epinephelus malabaricus），隶属鲈形目（Perciformes）、科（Serranidae）、石斑鱼属（Epinephlus）.其营养丰富，肉质鲜美，蛋白含量高，富含必需氨基酸，为优质的食用经济鱼类，是许多国家捕捞和养殖的对象.本课题组以点带石斑鱼为实验材料，从鱼皮和鱼鳞中提取胶原蛋白，并通过紫外吸收、氨基酸分析、SDS-PAGE 电泳分析和傅里叶变换红外光谱对胶原蛋白的纯度和结构特征进行研究，为点带石斑鱼胶原蛋白的制备和应用提供基础资料.

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 原材料预处理

点带石斑鱼冻品低温解冻后，在冰水浴中手工剥离鱼皮和鱼鳞，去除鱼皮下的脂肪、肌肉组织以及鱼鳞中的杂物，自来水洗净，沥干.

1.1.2 试剂与仪器

SDS-PAGE 相对分子质量标准蛋白，加拿大Fermentas 公司生产；牛跟腱Ⅰ型胶原蛋白标准品（BATC），北京索莱宝科技有限公司生产；L-羟脯氨酸、氯胺T、二甲基氨基苯甲醛、丙烯酰胺、N，N′-甲叉双丙烯酰胺、三羟基氨基甲烷（Tris）、过硫酸铵、四甲基二乙胺，均为北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司生产；所用试剂均为国产分析纯级.

双光束紫外可见分光光度计UV-1901，北京普析通用仪器有限公司生产；冷冻干燥机FPL1-1200，上海爱朗仪器有限公司生产；差示扫描量热仪DSC6220，精工电子纳米科技有限公司生产；高速低温离心机，赛默飞世尔科技（中国）有限公司生产；氨基酸全自动分析仪HITACH L-8900，日本HITACH 公司生产；傅里叶变换红外光谱仪Spectrum 65，美国PerkinElmer 公司生产；电泳凝胶成像分析仪SN-NJ060C，北京信诺莱伯仪器有限公司生产.

1.2 胶原蛋白的提取

将鱼皮剪碎，用体积分数为10%的正丁醇在4 ℃下搅拌脱脂24 h，蒸馏水洗净后用0.1 mol/L NaOH 在4 ℃下搅拌6 h，去除杂质蛋白.过滤，用蒸馏水洗至中性，冷冻干燥.

将鱼鳞浸泡于0.5 mol/L 的EDTA 溶液（pH7.4）中，4 ℃下搅拌脱钙48 h，每12 h 更换1 次溶液，然后用去离子水清洗，沥干，冷冻干燥.

1.3 胶原蛋白的纯化

称取1.2 中鱼皮和鱼鳞冻干品各2 g，分别加入0.5 mol/L 冰醋酸溶液搅拌24 h 后，10 000 r/min 离心30 min，沉淀用同样的条件再处理1 次，合并2次上清液，加NaCl 至终浓度0.9 mol/L，盐析过夜.10 000 r/min 离心30 min，弃上清液.沉淀用0.5 mol/L 冰醋酸溶液溶解，10 000 r/min 离心30 min.取上清液，重复盐析和溶解，用0.1 mol/L 冰醋酸溶液透析48 h 脱盐，再用蒸馏水透析24 h，冷冻干燥.所有处理及操作均在4 ℃下进行.

1.4 胶原蛋白纯度及理化性质测定

胶原蛋白纯度的测定，参照Reddy 等[2]的方法；热变性温度测定，参照Kanokwan 等[3]的方法；胶原蛋白氨基酸分析，参照GB/T 18246-2000 的方法；傅里叶变换红外光谱（FTIR），采用傅里叶变换红外光谱仪测定其吸收光谱，参照Wang 等[4]的方法；电动势及溶解度分析，参照Kanokwan 等[3]的方法.

紫外可见光谱扫描：准确称取纯化的胶原蛋白样品，溶解于0.5 mol/L 冰醋酸溶液中（4 ℃下进行），配成质量分数为0.05%胶原蛋白溶液.样品处理液采用双光束紫外可见分光光度计进行紫外可见光谱扫描，波长间隔1 nm，波长为190～400 nm.

SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）：参照Wang 等[4]的方法并稍作改动.即SDS-PAGE 采用6%（质量分数）分离胶与5%（质量分数）浓缩胶不连续电泳系统，具体配方如表1 所示.将胶原蛋白样品溶解于0.5 mol/L Tris-HCl（pH 6.8）至最终质量分数为0.1%，将样品溶液与样品缓冲液等体积混合，100 ℃水浴5 min 后取出立即放入冰水浴中冷却，然后4 ℃、10 000 r/min 离心10 min，取15 μL 上清液至垂直电泳槽，在50 mA 电流下电泳，最后进行染色脱色处理.

表1 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳配方Tab.1 Formula of SDS polyacrylamide gel electrophoresis mL

1.5 数据统计与分析

实验数据用平均值± 标准误差（Mean±SE）表示，在单因子方差分析的基础上采用Duncan 多重比较法检验组间差异（P=0.05）.所有数据均采用软件SPSS17.0 进行分析.

2 结果与讨论

2.1 胶原蛋白的提取率及其纯度

鱼皮胶原蛋白（SKC）和鱼鳞胶原蛋白（SCC）的提取率分别为76.21%和2.50%.吸光度值（A）和样品中羟脯氨酸浓度（C）呈线性正相关，回归方程为：A=0.073 4C+0.002 8（R2=0.999 3）.永井裕等[5]认为羟脯氨酸仅存在于胶原蛋白、弹性蛋白和伸展蛋白中，而不存在于一般蛋白质中，其在胶原蛋白中的含量为胶原氨基酸总质量的10%左右.

经测定，本研究提取的SKC 和SCC 的纯度分别为91%和85%.

2.2 紫外可见光谱扫描分析

将提取的SKC 和SCC 用0.5 mol/L 冰醋酸溶液溶解，在190～400 nm 的近紫外光区进行全波长扫描，结果如图1 所示.SKC 和SCC 在231 nm 处具有最大吸收峰，牛跟腱Ⅰ型胶原蛋白标准品在232 nm 处具有最大吸收峰，A 值分别为0.516、0.454 和0.532，符合胶原蛋白通常的紫外吸收特性，即SKC和SCC 存在Ⅰ型胶原蛋白的特征吸收峰.

2.3 热变性温度（DSC）的测定

SKC 和SCC 的DSC 曲线如图2 所示.SKC 的热变性温度为40.16 ℃，SCC 的热变性温度为42.06 ℃，这表明SCC 的热稳定性稍高于SKC.点带石斑鱼生活的水温在15～34 ℃，其胶原蛋白的热变性温度高于最大生长温度，这和一些温、热带鱼种来源的胶原蛋白相似，如尼罗河鲈鱼（生长温度18～32 ℃，胶原蛋白热变性温度36.5 ℃）、金枪鱼（生长温度20～28 ℃，胶原蛋白热变性温度29.7 ℃）、香鱼（生长温度20～28 ℃，胶原蛋白热变性温度29.7 ℃）等[4，6-7].这表明胶原蛋白的热稳定性与来源物种的种类和栖息环境温度有关，此结论与Rigby 的报道一致[8].

2.4 氨基酸组成

表2 中给出了点带石斑鱼SKC 和SCC 的氨基酸组分的质量分数.SKC 和SCC 中含量最丰富的氨基酸为甘氨酸，丙氨酸、谷氨酸和脯氨酸的含量也很高，而甲硫氨酸、组氨酸含量较低，半胱氨酸和酪氨酸没有发现，符合胶原蛋白的氨基酸组成分布[9].鱼皮和鱼鳞亚氨基酸（脯氨酸）含量分别为4.84%和5.60%，点带石斑鱼较低的亚氨基酸含量与较低的变性温度符合“蛋白质的热稳定性与亚氨基酸含量呈正相关”这一结论[10].

表2 提取胶原蛋白的常规氨基酸组成Tab.2 Composition of amino acid in soluble collagens extracted from scales and skin of grouper %

2.5 傅里叶变换红外光谱（FT-IR）

图3 和表3 显示了点带石斑鱼SKC、SCC 的红外吸收光谱及主要吸收峰.

表3 点带石斑鱼SKC 和SCC 的光谱峰位及其归属Tab.3 FTIR spectra peak locations and assignments for acid soluble SKC and SCC of grouper

AmideⅠ带和蛋白质的二级结构有关，SKC和SCC 的Amide Ⅰ带分别出现在1 656.95 和1 641.35 cm-1，说明这2 种胶原蛋白的二级结构相似.Amide Ⅲ带是由N—H 弯曲振动引起的特征吸收峰，SKC 和SCC 的Amide Ⅲ带分别出现在1 239.58和1 240.00 cm-1，证明提取的胶原蛋白存在完整的三螺旋结构[11].Amide A 峰与N—H 伸缩振动有关[12]，根据Doyle 理论，游离的N—H 伸缩振动在3 400～3 440 cm-1，N—H 参与氢键形成时振动频率显著降低.SKC 的Amide A 在3 436.16 cm-1，SCC 的Amide A 在3 435.94 cm-1，说明2 种胶原蛋白中几乎没有或者有很少的N—H 键参与氢键形成.SKC 的AmideⅠ和AmideⅡ吸收峰振动频率（分别为1 656.95 cm-1，1 551.33 cm-1）稍高于SCC的值（1 641.35 cm-1，1 554 cm-1），这些峰的振动频率与胶原蛋白的分子有序度呈正相关[13]，因此说明SKC 具有比SCC 更高的分子有序度.

2.6 SKC 和SCC 的组成及相对分子质量

SKC 和SCC 样品经SDS-PAGE 电泳后，结果如图4 所示.

鱼皮和鱼鳞所提取出来的胶原蛋白结构相似，属于Ⅰ型胶原蛋白，除了α1和α2链，还有β 和γ链，如表4 所示.通常认为β 链为α 链的二聚体，而γ 链为α 链的三聚体.α1和α3组分在SDS-PAGE胶上无法辨别[21]，因此条带α1还可能含有α3成分.

表4 鱼皮、鳞片胶原蛋白的相对分子质量（以0.8 mg/mL 为例）Tab.4 Chain molecular weight of collagens from skin and scales（0.8 mg/mL，for example）

2.7 电动势分析

SKC 和SCC 在不同pH 条件下的电动势如图5所示.在pH 为2～7 范围内，电动势值均为正值，而在pH 为8 和9 时出现负值.由于净电荷为零处被认为是蛋白质的等电点，因此，由图5 可得，SKC和SCC 的等电点分别为pH 7.12 和7.15，两者等电点极为相似，这可能与其氨基酸组成的含量有关.

2.8 溶解性

不同pH 条件下点带石斑鱼SKC、SCC 的溶解性结果如图6（a）所示.在酸性pH（2～4）内，两者都表现出高的溶解性（P≤0.05）.pH 值高于4 时，两者的溶解度均表现出不同的下降趋势，在中性和弱碱性条件下溶解性降至最低.本文结论与Bae 等[22]对虎皮胶原蛋白的研究结果相似.

不同浓度的NaCl 溶液对石斑鱼SKC、SCC 的溶解性影响结果如图6（b）所示.在10 和20 g/L NaCl 质量浓度下两者的溶解性与对照组（0 g/L NaCl 质量浓度）差异不具有统计学意义（P ＞0.05）.当NaCl 质量浓度大于30 g/L 时，2 种蛋白的溶解度急剧下降，这与Ahmad 和Benjakul[23]的结论相同.NaCl 质量浓度在40～60 g/L 时，SKC、SCC 的溶解度很低，这很可能是蛋白质的盐析现象.Woo 等[24]和Bae 等[22]分别从黄鳍金枪鱼、褐篮子鱼、海圆脸鱼类、燕魟、赤魟和烟台黄貂鱼的背部鱼皮中提取出胶原蛋白，当NaCl 质量浓度在40 g/L 时其溶解度也表现出急剧下降趋势.这也与本研究结果相似.

3 结论

本研究从点带石斑鱼的鱼皮和鱼鳞中提取出了胶原蛋白，并对这2 种胶原蛋白的理化性质进行分析，结论如下：

（1）鱼皮中胶原蛋白的提取率远远大于鱼鳞中的提取率，且纯度也高于鱼鳞中的胶原蛋白，证明鱼皮更适用于提取胶原蛋白；

（2）鱼皮和鱼鳞中的胶原蛋白均为Ⅰ型，含有α1、α2、β 和γ 链，并且具有完整的三螺旋结构，二者的氨基酸组成符合一般胶原蛋白的氨基酸组成规律；

（3）2 种胶原蛋白都是在酸性条件和低NaCl 浓度下有较高的溶解度，符合一般胶原蛋白的溶解性特征.

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