KIF4A mRNA 在肺癌组织中表达水平的研究

张三凤，赵 健，朱长军，董智雄

（天津师范大学a.生命科学学院，b.天津市动植物抗性重点实验室，天津 300387）

肺癌是一种严重危害人类健康的恶性肿瘤，也是发病率和死亡率最高的癌症，近年来该病的发病率和死亡率持续上升.随着分子生物学的发展，肺癌的治疗进入了分子靶向治疗的新阶段，分子靶向治疗已全面融入到了肺癌治疗的各个阶段.根据不同患者肺癌组织分子生物学方面的改变，制定个体化的治疗方案将是今后的研究重点.因此，寻找新的肿瘤分子标记物用于肺癌的诊断和治疗成为当前研究的热点[1-3].

细胞染色体中，非整倍体以及染色体的不稳定性源于有丝分裂过程中染色体的错误分离，常常会引起肿瘤的发生[4].纺锤体微管和着丝粒DNA 的准确连接对于染色体的正确分离至关重要，这个过程需要许多与纺锤体和着丝粒微管动力学有关的驱动蛋白参与[5].KIF4A 是一种染色体结合驱动蛋白（chromokinesin），也是一种多功能动力蛋白分子，它参与有丝分裂过程中纺锤体的形成[6]、染色体的凝集与分离[7]、DNA 的损伤应答[8]和细胞骨架的动态不稳定性[9]等.KIF4A 蛋白分子的功能多样性使其与人类各种重大疾病的发生发展密切相关.Mazumdar 等[10]检测KIF4A 在NCI-60（含有60 种不同人肿瘤细胞株）肿瘤细胞中的表达，发现35%的细胞株KIF4A 蛋白低表达或无表达，继而应用基因敲除技术，发现KIF4A 无表达导致胚胎干细胞染色体超凝集化并呈现染色体非整倍体，在裸鼠体内植入该胚胎干细胞后可以形成肿瘤，这充分表明KIF4A 与肿瘤的发生密切相关.Taniwaki 等[11]研究发现在肺癌组织中KIF4A 的mRNA 表达量高于正常组织.基于这些研究，推测KIF4A 可能与肺癌的发生发展有一定的关系.

本课题组以β-Actin（肌动蛋白）为内参，采用实时定量PCR 的方法检测肺癌组织和正常肺组织中KIF4A mRNA 表达水平的差异，分析其表达量与肿瘤淋巴结转移分期的关系，为进一步研究KIF4A 与肺癌的发生发展、临床特征指标的相关性奠定基础.

1 实验材料与方法

1.1 组织标本

31 例肺癌组织标本和3 例正常肺组织标本均由山东大学齐鲁医院提供.其中，肺癌组织标本来源于只接受了外科手术治疗的肺癌病人，包括男性24 例，女性7 例，病人的年龄、性别、症状和病理学类型等都来源于临床病理记录.肺组织标本在提取RNA 之前，均保存于液氮中.

1.2 试剂

氯仿、无水乙醇、异丙醇，天津科威公司生产；Trizol，宝生物工程（大连）有限公司生产；IMProm-IIIM 反转录系统，美国Promega 公司生产；qRTPCR（SYBR Green）Kit，天根生化科技（北京）有限公司生产.

1.3 实验方法

1.3.1 总RNA 提取

切取肺癌组织和正常的肺组织各0.1～0.2 g，分别加入1 mL Trizol，按试剂说明书中的操作步骤进行RNA 提取，最后用DEPC 水进行溶解，取2 μL测定其浓度，其余的放入-80 ℃下保存.

1.3.2 逆转录PCR

取上述已测定浓度的RNA 2 μg，使用IMProm-IIIM 反转录系统进行反转录PCR，得到cDNA.反转录体系如下：

Ⅰ：RNA 2 μg、Oligo dT primer 1 μL、DEPC水，共11 μL，70 ℃水浴放置10 min，冰浴2 min.

Ⅱ：5×M-MLV Reverse Transcriptase Buffer 4 μL、dNTP 4 μL、M-MLV Reverse Transcriptase 1 μL，共9 μL，将Ⅱ加入Ⅰ中，共20 μL.

反转录循环设计：变性温度95 ℃，时间为5 min；退火温度42 ℃，时间为1 h；25 ℃下保温10 min.

1.3.3 实时定量PCR（RT-PCR）

将上述反转录后得到的cDNA 用4 倍体积的高压去离子水稀释，进行实时定量PCR 实验.其中β-Actin、KIF4A 的引物如下：

以1.3.2 中反转录得到的cDNA 为模板，体系设计如下：

体系1（Actin）：水4 μL，primer1 2 μL，primer2 2 μL，模板2 μL，premix 10 μL.

体系2（KIF4A）：水4 μL，primer3 2 μL，primer4 2 μL，模板2 μL，premix 10 μL.

循环设计：第1 步，95 ℃、3 min；第2 步，95 ℃、15 s，58 ℃、20 s，68 ℃、30 s.40 个循环，每个循环结束后采集荧光信号，荧光信号强度超过基线时，记录其阈值循环数（Ct 值），结果为3 次实验的平均值.

1.4 数据处理

采用2-ΔΔCT法计算基因的相对表达量.以正常肺组织作为对照，把对照组的表达量设为1，因此癌组织的表达量就是对照组该基因表达量的N 倍，比例代表肺癌组织与正常肺组织中KIF4A mRNA表达量的比值.采用SPSS 13.0 软件分析各组间差异，进行T 检验，P ≤0.05 时表示差异有统计学意义.

2 结果

2.1 KIF4A 和β-Actin PCR 反应溶解曲线

用实时定量PCR 方法检测KIF4A mRNA 在标本中的表达水平，KIF4A 和β-Actin 的溶解曲线如图1 和图2 所示，显示二者基因PCR 产物的溶解曲线峰值都在88 ℃，溶解温度均一，并且峰的形状都较为锐利.这表明PCR 扩增特异性较强，无明显的引物二聚体或其他非特异性杂带出现.

2.2 肺癌组织和正常肺组织中KIF4AmRNA 的表达

如图3 所示，KIF4A mRNA 在正常肺组织和肺癌组织中都有表达，且31 例肺癌组织中有29 例的KIF4A mRNA 表达水平高于正常组织，其中26 例（83.87%）比正常组织高2 倍以上，10 例（32.30%）比正常组织高4 倍以上.由此可见，肺癌组织中KIF4A mRNA 的表达水平显著高于正常组织，二者之间的差异具有统计学意义（P≤0.01）.

2.3 肺癌组织中KIF4A mRNA 表达与临床病理特征的相关性分析

肺癌组织标本的检测信息结果如表1 所示.从表中可以看出，在鳞癌与腺癌中，KIF4A mRNA 表达量的差异不具有统计学意义（F=0.615，P=0.863）.KIF4A mRNA 的表达量与肺癌组织分化程度之间（F=1.214，P=0.882）和淋巴结转移之间（F=1.153，P=0.739）的差异也不具有统计学意义.但KIF4A mRNA 的表达量在TNM 分期之间的差异具有统计学意义，TⅡ中的表达量要显著高于TⅠ中的表达量（F=0.565，P=0.029）.

表1 KIF4A mRNA 的表达量与肺癌各临床特征之间的关系Tab.1 Relationship between expression of KIF4A mRNA and lung cancer clinicopathological characteristics

3 讨论与结论

Taniwaki 等研究证实，采用RNAi（RNA 干涉）的方法沉默KIF4A 基因表达后，与正常细胞相比，肺癌细胞的生长受到明显抑制[8]，这说明KIF4A 可能是肺癌细胞生长过程中一个重要的生长因子.本研究通过对肺癌组织和正常组织中KIF4A mRNA表达水平的检测和比较，发现在肺癌组织中KIF4A mRNA 的表达水平显著高于正常组织，表明KIF4A mRNA 的表达量与肺癌的发生发展有明确的相关性.Taniwaki 等的研究进一步证实KIF4A 的表达量对肺癌细胞的侵袭有一定的影响[8]，由此推测KIF4A可能通过影响细胞的侵袭功能而发挥致癌作用，但KIF4A 表达量增高的具体分子机制尚不清楚.临床病理因素分析表明，KIF4A mRNA 的表达量与有无淋巴结转移、病理组织类型和肺癌细胞分化程度的差异不具有统计学意义，KIF4A mRNA 的表达量在TNM 分型中的差异有统计学意义，在TⅡ中KIF4A mRNA 的表达量显著高于TⅠ.而T 分型与病人的远期预测即存活率有关，意味着KIF4A 可能与肺癌的预后（存活可能概况）存在一定的相关性.

综上所述，KIF4A 可能成为肺癌的新型标记分子和治疗靶标，同时也可以作为其预后的标志分子.

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