漆酶对共基质体系下吲哚的去除研究

任大军，鲍 欣，张元元，吴高明

（1.武汉科技大学资源与环境工程学院，湖北 武汉，430081；2.武汉钢铁（集团）公司安全环保部，湖北 武汉，430083）

吲哚是一种典型的氮杂环化合物（NHCs），广泛存在于焦化、染料、制药、农药等工业的废水及木材防腐处理场地周围的土壤和地下水中［1］。该类物质生物去除性较差，具有致癌、致畸、致突变的性质［2］。实际废水的水体成分复杂，不仅含有吲哚，还共存其他有机污染物如苯酚，它们会对微生物产生抑制作用，故采用一般的生物方法难以处理［3］。漆酶（Laccase）是一种含铜的多酚氧化酶（p－diphenol oxidase EC.1.10.3.2），具有较高的氧化还原电势，在没有H2O2和其他次级代谢产物存在的情况下，可对有机污染物的氧化起到催化作用。漆酶可以氧化的底物包括：酚类及其衍生物、芳胺及其衍生物和芳香羧酸及其衍生物等［4］。本文以吲哚为处理对象，选择废水中常见的酚类污染物苯酚作为吲哚的共存因子，以漆酶为处理试剂，研究复杂体系中各因子与漆酶的相互作用机制，以期为NHCs污染水体的修复提供参考。

1 试验材料与方法

1.1 酶与化学试剂

漆酶（白腐真菌侧耳属Pleurotus ostreatus）和2，2－连氮－双－（3－乙基苯并噻吡咯啉－6－磺酸）（ABTS），由Sigma公司生产，纯度高于99.9%；吲哚、苯酚、醋酸、醋酸钠均为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 漆酶对吲哚的去除试验

称取一定质量的纯漆酶，加入一定量的蒸馏水配成酶溶液，使其实测酶活力值与实验所需酶活力值误差不超过5%。

将醋酸和醋酸钠分别用蒸馏水定容后避光保存，配制成0.1mol／L的溶液后，再将两种溶液按不同的体积比配制成试验所需pH值的醋酸－醋酸钠缓冲溶液，其醋酸根的离子浓度始终保持在0.1mol／L，记为0.1M。

以I表示吲哚，P表示苯酚，分别按如下配方配制出两种混合反应体系：

（1）I单基质体系：1mL的醋酸－醋酸钠缓冲液（0.1M）、1mL的漆酶溶液、0.5mL的吲哚和0.5mL的蒸馏水。

（2）I＋P共基质体系：1mL的醋酸－醋酸钠缓冲液（0.1M）、1mL的漆酶溶液、0.5mL的吲哚和0.5mL的苯酚。

两种体系的总体积均为3mL，将反应液放入10mL的HACH管中，在常温避光条件下反应一段时间后，测溶液中剩余苯酚和吲哚的浓度。

1.2.2 检测方法

吲哚、苯酚浓度的测定：样品先经过0.45μm的滤膜，然后采用Agilent公司的HPLC1100高效液相色谱仪测定吲哚及苯酚浓度。检测条件为：流动相为甲醇和水（体积比为60∶40），流速为0.8mL／min，检测波长为270nm，进样量为20μL。

2 结果与分析

2.1 反应时间对漆酶去除吲哚的影响

吲哚和苯酚初始浓度均为30mg／L、漆酶溶液初始活力值为0.33U／mL、体系pH值为3.5时，不同体系中吲哚的去除率随反应时间的变化如图1所示。由图1中可见，漆酶对两类基质体系吲哚的去除率都随着时间的延长而升高，共基质体系中吲哚的去除率基本上高于单基质体系相应值，反应时间为12～24h时，共基质体系中吲哚的去除率比单基质体系中吲哚的去除率约高10个百分点，这表明苯酚的加入促进了漆酶对吲哚的去除。研究发现漆酶单独去除吲哚、苯酚及去除吲哚和苯酚混合物的反应过程中体系颜色变化都非常明显，只含有苯酚的去除体系由白色变为浅黄色；只含有吲哚的去除体系由白色变为透明黄色；含有苯酚和吲哚的去除体系由白色先变为黄色后又变为咖啡色。反应48h时共基质体系中有咖啡色物质沉淀出来，上清液颜色变淡；而单基质体系中没有沉淀，液体颜色无太大变化；只含苯酚和吲哚的体系中，液体颜色始终是无色透明的。以上现象表明，没有漆酶的情况下，苯酚不能与吲哚发生反应；苯酚的加入改变了漆酶对共基质中吲哚的去除作用机制。

图1 反应时间对不同体系中吲哚去除率的影响Fig.1 Effect of reaction time on indole removal rate

2.2 pH值对漆酶去除吲哚与苯酚的影响

吲哚和苯酚的初始浓度均为30mg／L、漆酶溶液初始活力值为0.33U／mL时，不同pH值下反应24h时吲哚和苯酚去除率如图2所示。由图2中可见，漆酶对单基质体系中吲哚的去除率随着pH值的升高而降低，而对共基质体系中吲哚的去除率先降低后增高。共基质体系中，pH值为3.5时吲哚的去除率最高，为50.7%，pH值为5.5时吲哚的去除率达到最低值29.6%。pH值为6.5时，与单基质体系相比，共基质体系中吲哚的去除率提高了约30个百分点。

图2 不同pH值体系下漆酶对吲哚和苯酚的去除效果Fig.2 Effect of pH on indole and phenol removal rate

由图2中还可见，共基质体系中苯酚的去除率随着pH值的增大而提高，pH值为6.5时，反应24h时苯酚的去除率接近60%。共基质体系中，当pH值为3.5～5.0时混合体系中吲哚的去除率大于苯酚的去除率；而当pH值为5.0～6.5时，苯酚的去除率大于吲哚的去除率，这是由于漆酶催化去除底物的最合适pH值与底物的化学结构有关。底物与酶活中心的氧化还原电势差决定了底物的氧化速率［4］，苯酚的结构较简单，其氧化还原电势较低（＜0.8V）［5］，漆酶更容易与其先发生反应［6］。吲哚的溶解度较低，不易接近酶活中心，且氧化还原电势（＜1.035V）高于苯酚［7］。随着pH值从6.5逐渐降至3.5，吲哚易与溶液中H＋形成相应的共轭酸［8］，增强了吲哚的亲水特性，使吲哚更容易接近酶分子表面，从而提高了吲哚的去除率。而随着pH值从3.5逐渐升高至6.5，苯酚的氧化还原电势减小，漆酶的氧化还原电势基本不变［4］，苯酚与酶活中心的电势差增大，漆酶氧化苯酚的速率加快。酚类化合物也可以作为漆酶的介体物质，漆酶催化反应速率是由酚类化合物氧化态的形成速率决定［9］。共基质中当溶液pH值高于5.0，苯酚的氧化产物生成的速率加快，然后苯酚中间产物与漆酶组成了新的介体系统，促进了吲哚的去除。因此在较高的pH值下，吲哚的去除率反而升高。

2.3 酶初始活力值对漆酶去除吲哚与苯酚的影响

选取pH值为3.5和6.5，吲哚和苯酚的初始浓度均为30mg／L，不同酶初始活力值下反应24 h时吲哚和苯酚的去除率如图3所示。由图3中可见，在两类基质中漆酶对苯酚、吲哚的去除率随着酶初始活力值的增大而提高；共基质体系中吲哚的去除率基本上高于单基质吲哚的去除率；当溶液pH值为3.5时，吲哚的去除率高于溶液pH值为6.5时的相应值。提高漆酶的活力值有利于增加酶与吲哚及苯酚的接触机会，从而提高了苯酚与吲哚的去除率。而中性偏酸性的环境及酶初始活力值的增大都有利于苯酚中间产物的生成，然后苯酚中间产物可与漆酶组成新的介体系统，促进了漆酶对吲哚的去除。由于漆酶初始活力值的大小是通过改变漆酶溶液的浓度获得，酶初始活力值与漆酶的用量成正比，因此与单基质体系中去除吲哚相比，苯酚的加入减少了漆酶的用量。

图3 酶初始活力值对苯酚与吲哚去除率的影响Fig.3 Effect of enzyme activity on phenol and indole removal rate

2.4 苯酚浓度对漆酶去除吲哚的影响

吲哚初始浓度为30mg／L、漆酶溶液初始活力值为0.33U／mL、pH 值为3.5和6.5时，不同苯酚初始浓度下反应24h时吲哚的去除率如图4所示。由图4中可见，苯酚初始浓度与吲哚的去除率具有良好的线性相关性，苯酚的存在可以增强漆酶对吲哚的去除效果。Calcaterra等［10］发现在对苯二酚、酚红存在的情况下，漆酶可以氧化非酚类化合物。一般认为酚类化合物并不是像2，2－连氮－双－（3－乙基苯并噻吡咯啉－6－磺酸）（简称ABTS）那样传统意义上的介体，因为它会被漆酶去除且中间产物不稳定［11］。González［12］研究了16种酚类化合物对苯甲醇的电化学行为，发现这些酚类化合物与1－羟基苯并三唑（HBT）及藜芦醇（VA）的行为类似，认为酚类化合物与漆酶的接触方式属于H－abstraction氧化机理。因此苯酚及其氧化产物与漆酶可能组成了新的“介体”系统，促进了吲哚的去除。随着溶液中苯酚初始浓度升高，苯酚氧化态形成的速率增大，反应加快，吲哚的去除率升高。

3 讨论

图4 苯酚初始浓度对吲哚去除率的影响Fig.4 Effect of phenol initial concentration on indole removal rate

酶的催化反应速率与溶液pH值、水中氧气浓度、底物种类及酶种类有关［4－6］。底物的电子转移至漆酶活性中心T1Cu的速率是限制漆酶催化反应的关键因素。电子的转移速率与T1Cu和底物的氧化还原电势差有关［4］。溶液pH值的变化对漆酶的氧化还原电势影响不大，T1Cu氧化还原电势约为0.785V［4］。吲哚的氧化还原电势随着溶液pH 值的增大而减小（＜1.035V）［7，13］，但是漆酶的酶促反应不仅与底物的氧化还原电势有关，还与底物的空间结构有关［4－5］。吲哚环上的电荷密度比苯酚环上低，吲哚的空间体积位阻效应增大，其疏水性也增大，不利于吲哚接近漆酶活性中心［14］。吲哚的环上含有N原子，随着溶液pH值的降低，易从溶液中获取H＋，生成相应的共轭酸［8］，增强了吲哚的亲水特性，使吲哚更容易接近酶分子表面，从而提高吲哚的去除率。因此，吲哚在酸性条件下去除效果更好，这也与漆酶和单基质吲哚反应现象相符。当加入苯酚以后，漆酶与苯酚的氧化还原电势差和溶解性都高于吲哚，苯酚将优先被漆酶氧化，而当溶液的pH值从3.5缓慢升至6.5时，苯酚的氧化还原电势随着pH值的增大而减小［9］，因此，漆酶与苯酚的氧化还原电势差增大。氧化还原电势差越大，电子的转移速度越快，当溶液pH值逐渐升高时，较高的氧化还原电势差会促使电子从苯酚向T1Cu更快地转移，从而使漆酶氧化更多的苯酚。目前酚类化合物也被发现可以促进漆酶去除污染物［9－11］，溶液pH值在中性偏酸性时，溶液中苯酚会先与漆酶反应；而后苯酚的氧化产物又充当了漆酶的“介体物质”，促进了吲哚的去除。当溶液pH值从6.5缓慢降至3.5时，苯酚的氧化产物浓度也随着下降，“介体物质”对吲哚的去除作用不占主导地位。在较低的pH值下，溶液中吲哚的去除主要依靠漆酶的氧化。

通过对比单基质和共基质下吲哚的去除率发现，漆酶不仅可以同时去除苯酚和吲哚，苯酚的存在还促进了吲哚的去除。在含有苯酚的反应体系中发现了沉淀。Michaela［15］也发现用漆酶处理苹果汁中酚类化合物时有褐色的沉淀。Hu［16］研究发现漆酶在有苯酚存在的情况下，对靛蓝染料废水的脱色率增加了80%。刘友勋［17］认为介体会先与漆酶发生反应生成介体氧化形态，然后在氧化态介体的介导作用下，染料被聚合最终生成不溶于水的沉淀物。吲哚为蓝色染料靛蓝的母核，与靛蓝有某些相似的化学性质，因此吲哚可能被苯酚的氧化态中间产物在介导作用下生成聚合物沉淀，使溶液中吲哚的浓度迅速降低。进入液相之前，溶液中的沉淀物质及颜色将会被截留在0.45μm的滤膜上，从而使含有苯酚的情况下，漆酶对吲哚的去除作用远大于不含有苯酚的情况。

4 结论

（1）与单基质体系相比，含有苯酚的体系中，漆酶对吲哚的去除效果更好。

（2）在共基质体系中，漆酶不仅可以同时去除苯酚和吲哚，苯酚的存在还改变了漆酶对吲哚的去除机理，促进了漆酶对吲哚的去除。共基质体系中，苯酚浓度与吲哚的去除率有良好的线性相关性，且苯酚的加入可以减小漆酶的用量。

（3）共基质体系中漆酶对吲哚的去除有两个较优pH值，分别为3.5和6.5。

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