一株含盐污水降解菌的分离鉴定及其降解特性研究

张晓青，杨 波，姜天翔，张雨山，王 静

(国家海洋局天津海水淡化与综合利用研究所，天津 300192)

海洋公益性行业科研专项项目(201105026)，国家海洋局青年海洋科学基金资助项目(2011152) 收稿日期：2013-10-12

作者简介：张晓青(1983-)，女，福建浦城人，工程师，研究方向：海水利用技术， E-mail：radicle@163.com。

doi

：10.3969/j.issn.1672-5425.2013.12.012

一株含盐污水降解菌的分离鉴定及其降解特性研究

张晓青，杨 波，姜天翔，张雨山，王 静

(国家海洋局天津海水淡化与综合利用研究所，天津 300192)

从塘沽海滩泥样中分离筛选出1株海洋细菌，标记为NY0935，该菌株对含盐污水中有机物有较好的去除效果。通过形态特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析，鉴定该菌株为卓贝尔氏菌属(Zobellellasp.)。将菌株NY0935投入到大生活用海水中，在温度为25～37 ℃、pH值为6.0～10.0、NaCl浓度为0～6%的条件下，菌株可以正常生长，且对COD保持较好的去除效果。当培养条件为37 ℃、摇床转速为160 r·min-1时，菌株NY0935在大生活用海水中培养48 h后对COD去除率达到75.99%。

分离鉴定；耐盐菌；降解特性；化学需氧量

海水直接利用包括工业生产用水和生活用水，海水在居民生活用水方面除了冲厕外，还可以用于洗浴、空调、景观等[1]。随着世界经济的发展和海水利用技术的日益成熟，海水利用产业在全世界范围内得到快速发展。当前，我国水资源短缺特别是水质性短缺问题十分严重，为了缓解淡水资源日益紧缺的局面，国家和沿海城市相继出台了一系列海水利用政策，建立海水利用产业化基地，将海水应用于循环冷却、生活用水、海水源热泵等[2]。海水利用节约了淡水资源，但也导致排放的废水中除了含有有机污染物外，还含有大量的无机盐[3,4]。传统的活性污泥法、生物膜法等污水处理工艺在处理高盐度污水时常遇到以下问题：高盐度不仅使微生物的酶活性丧失，而且会改变渗透压使微生物的细胞膜破裂，降低处理效果；高盐度还会改变污泥中微生物的组成，导致污泥流失严重，造成二次污染[5]。

生物强化技术是为了提高废水处理系统的处理能力，向系统中投加从自然界筛选的优势菌种或通过基因组合技术产生的复合菌，以去除某一种或某一类有害物质[6]。国外研究者选育耐盐菌处理高盐度有机废水，并且探讨了盐度对生化系统处理有机废水的影响[7-9]。Wilén等[10]研究发现生物强化技术可以使有机物去除率比单纯普通活性污泥法提高20%，污泥产量减少34%，减轻了二次污染。

作者从塘沽海滩泥样中分离、筛选出1株具有良好有机物降解能力的菌株NY0935，对其生长特性及降解能力进行初步的研究，并进行了菌株形态、生理生化特征和16S rDNA序列测定，为菌株NY0935处理含盐污水的实际应用提供了生物学理论依据。

1 实验

1.1 材料与培养基

1.1.1 泥样

泥样取自天津塘沽下邮局码头泥滩，新鲜取用。

1.1.2 大生活用海水

葡萄糖 300 mg·L-1，NH4Cl 41 mg·L-1，K2HPO49.4 mg·L-1，MgSO4·7H2O 50 mg·L-1，pH值6.5～7.5，污水中海水比例为40%，海水取自天津塘沽近海水域。

1.1.3 培养基

分离培养基(2216E):蛋白胨5 g，酵母提取物1 g，高磷酸铁0.1 g，陈海水1 L，pH值7.6[11]。

营养琼脂培养基:蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化钠5 g，琼脂15 g，pH值7.0～7.2[12]。

1.2 方法

1.2.1 菌种的富集和分离纯化

将泥样用灭菌蒸馏水溶解，空曝24 h，静置后取上清液接入2216E液体培养基中，37 ℃、160 r·min-1下摇床培养3 d左右，培养液变浑浊后，再按1%接种量接入新鲜的2216E液体培养基中，继续培养，如此重复3～5次，然后在2216E固体培养基平板上划线，挑取菌落特征有明显差异的单菌落继续划线分离，直至获得单一菌株。将菌株接种于牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养基上，培养24 h，置于4 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 细菌生长和生理生化指标测定

细菌生长以波长600 nm处的浊度OD600表示。API ZYM 19种酶活检测、API 20NE 21项指标检测及过氧化氢酶、氧化酶、G+C含量、脂肪酸含量等指标测定参照文献[13]进行。

1.2.3 菌株16S rDNA基因序列测定和分析

采用CTAB/NaCl法提取菌株总DNA，采用细菌16S rDNA基因通用引物(fd1：5′-AGAGTTTG ATCC-

TGGCTCAG-3′，rp2：5′-ACGGCTACCTTGTTACG-

ACTT-3′)进行16S rRNA基因片段的PCR扩增，引物由上海生工合成。

PCR反应体系为：dNTP 2 μL，Tag酶0.5 μL，引物2 μL，Loading buffer 2.5 μL，模板2 μL，水16 μL。

PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min，然后进入以下循环：94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，35个循环后于72 ℃延伸 10 min。

PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳检测，PCR产物用UNIQ-10柱式PCR扩增产物纯化试剂盒(上海生工)纯化后连接在PMD18-T(TaKaRa)上。测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。将所测得菌株的16S rDNA 基因序列与GenBank 数据库中已存在序列进行Blast分析，利用Phylip软件构建系统发育树，以确定该菌株的分类地位。

1.2.4 菌株降解能力测定

将菌株接入2216E液体培养基中，在37 ℃、160 r·min-1条件下培养过夜，取对数生长期的菌体，按照2%(体积比)的接种量接入大生活用海水中，在37 ℃、160 r·min-1条件下培养48 h，测定培养液COD的变化。COD测定采用重铬酸钾法[14]。

1.2.5 菌株降解特性的研究

为研究菌株对含盐污水的降解特性，分别以5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0作为pH值实验组；分别以15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、37 ℃、40 ℃作为温度实验组；分别以0、2%、4%、6%、8%、10%、12%作为NaCl浓度实验组，考察环境因子对菌株生长和COD去除的影响。以上各实验组大生活用海水量均为100 mL，培养条件为37 ℃、160 r·min-1恒温摇床振荡培养，培养48 h后测定COD和OD600值。

2 结果与讨论

2.1 菌株分离与筛选

经过5次富集驯化培养后，得到耐盐混合菌群培养液。将混合培养物在2216E平板上划线分离，经过复筛、纯化后得到5株耐盐菌。其中一株对大生活用海水COD有较高去除率，编号为NY0935。

2.2 菌株NY0935的菌落形态及生理生化特征

菌株NY0935在2216E固体培养基上37 ℃培养2 d后菌落呈浅黄色，圆形且不透明。在原子力显微镜下观察，菌体呈长杆状，大小为1.3 μm×0.6 μm，见图1。

图1 菌株NY0935的原子力显微镜照片Fig.1 AFM Photos of strain NY0935

生理生化实验表明，菌株NY0935能还原硝酸盐，氧化酶、过氧化氢酶实验为阳性，脲酶实验为阳性，吲哚反应为阴性，能发酵葡萄糖产酸，精氨酸双水解反应为阳性，能利用D-葡萄糖、D-甘露醇、N-乙酰葡萄糖胺、D-麦芽糖、葡萄糖酸钾、苹果酸、柠檬酸三钠、苯乙酸、L-阿拉伯糖、D-甘露醇为碳源。

全细胞脂肪酸分析结果显示，菌株NY0935以十八碳烯酸(C18：1)和十六碳烯酸(C16：1)为主要成分，含量分别为35.83%和30.12%。

菌株NY0935的API ZYM 19种酶活检测、API 20NE 21项指标检测结果分别见表1、表2。

2.3 菌株NY0935的16S rDNA鉴定

菌株NY0935的16S rDNA基因序列在GenBank中的登录号为GQ922076。将其与GenBank中已收录的16S rDNA序列进行同源性比较发现，菌株NY0935的16S rDNA基因序列与Zobellellataiwanensisstrain ZT1(GenBank登录号为DQ195676.1)序列相似度为99%。

通过与数据库同源性较高的模式菌株进行比较，构建系统发育树(图2)，发现NY0935与Zobellellasp.菌株在同一分支上。细菌分类学家认为当某2种细菌的16S rDNA相似度大于95%时，可以将其归为同一属。结合生理生化及分子鉴定结果，将菌株NY0935鉴定为卓贝尔氏菌属(Zobellellasp.)。

表1APIZYM19种酶活检测结果

Tab.1Analysis results of enzymatic activity for 19 kinds of enzyme by API ZYM

注：“0”代表阴性；“1”和“2”代表弱阳性；“5”代表阳性

表2API20NE21项指标检测结果

Tab.2Analysis results of 21 indexes by API 20NE

注：“+”代表阳性；“-”代表阴性；“W”代表弱阳性

图2 菌株NY0935的系统发育树Fig.2 The phylogenetic tree of strain NY0935

2.4 菌株NY0935对大生活用海水COD的去除效果

将菌株NY0935按照2%(体积比)的接种量接入大生活用海水中，对COD的去除效果见图3。

图3 菌株NY0935对大生活用海水COD的去除Fig.3 The COD removal of seawater for routine life by strain NY0935

从图3可以看出，菌株NY0935对大生活用海水的净化效果明显。随着菌株NY0935的生长，培养24 h后COD浓度从305.6 mg·L-1降低到118.8 mg·L-1，培养48 h后COD去除率达75.99%。

2.5环境因子对菌株NY0935生长和COD去除的影响

2.5.1 温度对菌株NY0935生长和COD去除的影响

温度是影响微生物生长繁殖的重要因素，能直接影响菌体内部酶的活性，从而影响生物体的生命活动。考察温度对菌株NY0935生长和COD去除的影响，结果见图4。

图4 温度对菌株NY0935生长和COD去除的影响Fig.4 Effect of temperature on growth of strain NY0935 and removal of COD

从图4可以看出，菌株NY0935的温度适应范围较广，在15～40 ℃范围内均能正常生长，其生长较适宜的温度为25～37 ℃，该范围内温度对菌株生长和COD去除影响不大，在COD初始浓度为324.5 mg·L-1时，COD的去除率均达到62%以上，且菌株的OD600值均达到0.8以上。

2.5.2 pH值对菌株NY0935生长和COD去除的影响

微生物的生理活动和环境的酸碱度密切相关，只有在适宜的酸碱度条件下，微生物才能进行正常的生理活动。不同微生物有不同的pH值适应范围，大多数细菌适应中性环境和偏碱性环境。考察pH值对菌株NY0935生长和COD去除的影响，结果见图5。

图5 pH值对菌株NY0935生长和COD去除的影响Fig.5 Effect of pH value on growth of strain NY0935 and removal of COD

从图5可以看出，pH值对菌株NY0935的生长和COD去除影响较大。pH值在6.0～10.0范围内，菌株NY0935生长较好，OD600和COD去除率分别达0.85和62.2%以上；当pH值低于5.0或大于11.0时，菌株NY0935几乎不能生长，COD去除率很低。因此，在含盐污水处理过程中保持适宜的pH值十分重要，在本实验条件下，适宜的pH值范围为6.0～10.0。

2.5.3 NaCl浓度对菌株NY0935生长和COD去除的影响

微生物对环境盐度变化较为敏感，盐度升高会改变渗透压使微生物的细胞膜破裂，失去活性，降低处理效果。考察NaCl浓度对菌株NY0935生长及COD去除的影响，结果见图6。

图6 NaCl浓度对菌株NY0935生长和COD去除的影响Fig.6 Effect of NaCl concentration on growth of strain NY0935 and removal of COD

从图6可以看出，NaCl浓度在0～6%范围内，菌株NY0935能够较好地生长，对COD保持较高的去除率。随着NaCl浓度的升高，菌株生长量减少、COD去除率降低，在NaCl浓度大于12%的情况下，菌株完全不生长。菌株在NaCl浓度为4%时生长最好，OD600达0.881，说明菌株的生长需要一定的盐度，属于广域嗜盐菌。

3 结论

从塘沽海滩泥样中分离、筛选出菌株NY0935，将菌悬液按2%(体积比)投加量投加到大生活用海水中，可以显著提高含盐污水中有机物的去除率，48 h后COD去除率达75.99%。通过形态特征、生理生化特征以及16S rDNA基因序列分析，将NY0935鉴定为卓贝尔氏菌属(Zobellellasp.)。目前尚无该属菌株用于含盐污水处理的报道，这拓宽了人们对卓贝尔氏菌属在其功能方面的应用研究思路，并为含盐污水处理提供了高效菌种，具有较高的实用价值。

通常情况下，微生物降解有机物能力与环境pH值、温度等均有一定的关系，在自然环境中的降解能力还会受其它微生物的影响。本研究结果表明，菌株NY0935在温度为25～37 ℃、pH值为6.0～10.0、NaCl浓度为0～6%的范围内生长不受影响，说明菌株NY0935的适应pH值、温度、盐度等环境范围较宽，可以在自然环境中发挥其降解功能，在处理含盐有机污水方面具有广阔的应用前景。

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StudyonIsolationandIdentificationofASalinityWastewaterDegradingBacterialStrainandItsDegradingCharacteristics

ZHANG Xiao-qing，YANG Bo，JIANG Tian-xiang，ZHANG Yu-shan，WANG Jing

(InstituteofSeawaterDesalinationandMulti-PurposeUtilization,SOA,Tianjin300192,China)

A salt-tolerant bacterial strain named NY0935 was isolated from a soil sample which was collected from Tanggu,China.The strain NY0935 was identified asZobellellasp.by analysis of morphological features,physiological and biochemical characteristics,as well as phylogenetic analysis of 16S rDNA sequences.There was little effect on the growth of strain NY0935 under the culture conditions of 25～37 ℃,pH value of 6.0～10.0 and NaCl concentration of 0～6%.The COD removal rate was 75.99% when the strain NY0935 was cultured in the seawater for routine life for 48 h under the conditions of 37 ℃ and 160 r·min-1.

isolation and identification;salt-tolerant bacterial strain;degrading characteristic;COD

X 172

A

1672-5425(2013)12-0048-05