黄体酮对海水浸泡腹部开放伤大鼠胃黏膜损伤的保护作用

浦江，崔立红，刘超群，吴姗珊，李欣，李辉，罗哲

腹部开放伤海水浸泡是现代海战中较为常见的伤型。海水具有高渗、高钠、低温的特点并含有多种细菌，海水进入受伤腹腔后机体会产生强烈的应激反应，释放大量炎症介质，胃黏膜上皮细胞出现坏死，凋亡增加，导致胃屏障功能障碍[1]。本研究以大鼠腹部开放伤合并海水浸泡为模型，观察黄体酮对胃黏膜破坏、炎性反应及细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂 雄性Wistar大鼠30只，清洁级，体重180～220g，由军事医学科学院实验动物中心提供。羊抗大鼠caspase-3多克隆抗体(一抗)由美国SantaCruz生物工程公司提供；TUNEL检测试剂盒由德国Roche公司提供；鼠抗羊FITC-IgG二抗由北京中杉生物公司提供；黄体酮注射液购自上海通用药业股份有限公司。配方海水按国家海洋局第三研究所提供的人工海水配方配制。

1.2 动物模型制备 实验前动物禁食12h，自由饮水，以盐酸氯胺酮(10mg/kg)和速眠新(1ml/kg)配成麻醉剂，腹腔注射麻醉大鼠，取腹部正中纵行切口，长2～3cm，将浸泡于0.19%氯化钠溶液的塑料网片置入腹腔内，以手术圆针带线缝于腹壁上，防止浸泡过程中肠管挤出腹腔外。

1.3 动物分组及给药方法 将30只实验动物编号，利用随机数字表法分成3组，每组10只。A组：腹部开放伤+灭菌注射用水皮下注射；B组：腹部开放伤海水浸泡+灭菌注射用水皮下注射；C组：腹部开放伤海水浸泡+黄体酮治疗。A组大鼠开腹后敞开腹腔并浸入0.19%氯化钠溶液中浸泡；B、C组大鼠于开腹后敞开腹腔并浸入海水中浸泡。浸泡后1、6、12h按16mg/kg剂量分别于皮下注射灭菌注射用水或黄体酮。16h后处死全部大鼠。

1.4 方法

1.4.1 胃黏膜损伤情况观察 大鼠达到浸泡时限1h后迅速处死，标本取出后立即沿胃大弯侧剪开胃壁使黏膜面外翻，用冷生理盐水冲洗黏膜面血迹，将黏膜面向上平展于纱布上，在10倍放大镜下用游标卡尺测量胃黏膜损伤情况。按Guth等[2]的标准评分：点状病变为1分；病变长度＜1mm为2分；1～2mm为3分；2～4mm为4分；病变＞4mm为5分；病灶宽度＞1mm时分值×2。所有分值相加即为此只大鼠胃黏膜溃疡指数(ulcer index，UI)。

1.4.2 光镜下胃黏膜病理学观察 于胃黏膜损伤最明显处取胃组织0.5cm×1.0cm，置入4%甲醛中固定24h，常规石蜡包埋、切片、苏木素-伊红染色，行光镜病理检查。积分方法：对每张切片随机选取5个视野，每个视野按病变严重程度分级：0=正常，1=上皮细胞损伤和腺体破坏，2=黏膜的出血性损伤和不超过黏膜下层的坏死，3=超过黏膜下层的坏死和溃疡。5个视野得分累计为其组织学损伤积分。

1.4.3 胃黏膜炎症介质水平测定 将剪为1～2cm长短的胃体小弯用盐水冲洗，滤纸拭干称重，在冰水环境下用生理盐水和匀浆器制作成2～3ml胃黏膜组织匀浆，在4℃低温离心机离心15min后，收集上清液，按照试剂盒说明书应用酶联免疫法测定TNF-α、IL-6水平。

1.4.4 Caspase-3蛋白表达的免疫组化检测 采用EnVision二步法，经脱蜡，水化，3%H2O2处理去除内源性过氧化物酶，枸橼酸盐溶液高压修复抗原；滴加羊抗大鼠caspase-3多克隆抗体(1:100)，4℃过夜；滴加聚合物增强剂(试剂A)，37℃ 20min；滴加辣根过氧化物酶标记的鼠抗羊FITC-IgG二抗(试剂B)；DAB显色；镜下控制反应时间不超过5min，双蒸水终止反应；苏木素轻度复染，脱水、透明、封固、显微镜观察。caspase-3蛋白表达量以其阳性细胞在胃黏膜上皮细胞中的百分比表示。以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照。

1.4.5 TUNEL法检测凋亡细胞 采用TUNEL法原位标记DNA片段检测凋亡细胞，全部程序按试剂盒提供的操作手册进行，DAB显色。TUNEL阳性细胞为棕色。每片选5个高倍(×400)阳性视野，根据多媒体病理图像分析软件(Olympus公司)计数每个视野中的阳性细胞数。

1.5 统计学处理 采用SPSS 13.0软件进行统计学分析，计量资料采用x±s表示，组间均数比较采用Chisequare检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 胃黏膜病理学变化 光镜下病理学观察显示，海水浸泡腹部开放伤大鼠部分胃绒毛顶端脱落，血管扩张、充血，小血管内见较多嗜中性粒细胞聚集，隐窝细胞变性坏死，大多数胃黏膜病理损伤加重。应用黄体酮后，从病理改变上看上述情况均明显好转，黏膜下层和肌层水肿、出血减轻，黏膜层有移行修复表现，但少数黏膜全层坏死者，黏膜层病变改善不明显。

2.2 胃黏膜UI、组织学损伤积分及炎症介质水平测定 B组大鼠UI、黏膜组织学损伤积分与A组比较明显增加(P＜0.01)，C组与B组比较则明显降低(P＜0.05，表1)。B组大鼠胃黏膜组织匀浆TNF-α、IL-6浓度与A组比较均明显升高(P＜0.01)，C组与B组比较则显著下降(P＜0.05，表1)。

2.3 Caspase-3蛋白表达比较 Caspase-3阳性细胞为棕黄色颗粒，表达于细胞质。正常大鼠胃黏膜组织中，可见胞质内棕黄色颗粒样物质呈散在分布。B组caspase-3蛋白表达(23.8%±3.5%)与A组(10.2%±1.6%)比较明显增加(P＜0.01)；C组(17.1%±2.3%)与B组比较则明显下降(P＜0.05)。

表1 胃黏膜溃疡指数、组织学损伤积分及炎症介质水平比较(±s，n=10)Tab.1 Comparison of ulcer index, injury scales and inflammatory mediators of gastric mucosa s,n=10)

表1 胃黏膜溃疡指数、组织学损伤积分及炎症介质水平比较(±s，n=10)Tab.1 Comparison of ulcer index, injury scales and inflammatory mediators of gastric mucosa s,n=10)

(1)P＜0.01 compared with A group; (2)P＜0.05 compared with B group

Group Ulcer index Injury scales TNF-α(μg/L) IL-6(ng/L)A 0.4±0.09 2.4±0.85 0.4±0.05 260±12.14 B 1.8±0.12(1) 5.0±0.78(1) 1.3±0.15(1) 620±18.36(1)C 1.4±0.15(2) 4.4±0.43(2) 1.1±0.09(2) 494±14.20(2)

2.4 凋亡细胞检测 经TUNEL染色，阳性物质呈棕黄色，主要位于细胞核内，常聚集于核膜附近或核质呈现均匀染色。B组凋亡细胞百分比(26.4%±2.8%)与A组(8.5%±1.5%)比较显著增高(P＜0.01)，C组(19.8%±2.4%)与B组比较则明显下降(P＜0.05)。

3 讨 论

腹部开放伤海水浸泡后大鼠胃黏膜功能的主要变化包括应激性溃疡、胃动力障碍、胃黏膜屏障破坏以及胃黏膜吸收功能的改变等四个方面[3]。外伤、休克均可导致胃黏膜炎性介质过量生成，胃黏膜通透性增加。以往研究表明，腹部开放伤海水浸泡能够导致机体炎症因子水平异常增高，胃黏膜形态破坏，胃黏膜上皮细胞过度凋亡等[1,3-4]。

研究表明，孕激素在改善心肌细胞损伤及凋亡、肠道黏膜组织损伤、大脑组织炎症反应及功能恢复等方面有一定作用[5]，且女性比男性对于机体损伤具有更好的耐受性，女性海战伤伤员的全身脏器损伤程度比男性轻微[5]。皮质类固醇能有效缓解溃疡性结肠炎等炎症性肠病的肠道黏膜损伤，但其导致的继发细菌感染、骨质疏松等不良反应较为严重。与皮质类固醇相比，黄体酮不良反应较小。本研究观察黄体酮对腹部开放伤海水浸泡大鼠胃黏膜上皮的形态、炎性介质水平、上皮细胞凋亡等的影响。

腹部开放伤海水浸泡后胃黏膜上皮细胞显著凋亡可能是导致胃黏膜损伤的原因之一[1-2]。相关研究显示，腹部开放伤经海水浸泡后，胃黏膜炎性介质、黏附因子释放增加，中性粒细胞、单核细胞在胃黏膜组织聚集等因素都加剧了胃黏膜的炎性反应，造成胃黏膜结构显著损伤[5]。本研究表明，黄体酮能调节胃黏膜炎性细胞因子水平，降低海水浸泡后腹部开放伤大鼠胃黏膜组织的TNF-α和IL-6水平，降低溃疡指数及组织损伤程度。

本研究还显示，腹部开放伤经海水浸泡后，大鼠胃黏膜上皮细胞大量凋亡，caspase-3表达明显增加，表明腹部开放伤海水浸泡可以严重影响胃黏膜上皮细胞的凋亡状况，打破胃黏膜上皮细胞正常的增殖与凋亡比例，破坏胃黏膜内环境稳态，影响胃黏膜的正常结构从而导致功能障碍。经黄体酮处理后，腹部开放伤海水浸泡大鼠TUNEL阳性的凋亡细胞明显减少，caspase-3表达下降，有利于胃黏膜上皮层结构的维持及修复。

综上所述，本研究表明黄体酮能抑制腹部开放伤海水浸泡大鼠胃黏膜的炎性反应，保护其胃黏膜上皮的组织结构，减少胃黏膜细胞的凋亡发生，减少应激性溃疡及上消化道出血的发生概率，为海水浸泡腹部开放伤伤员的早期救治提供了可能。

[1]Li X, Wu SS, Sun T, et al. Effect of seawater immersion on intestinal barrier following open abdominal injury in dogs[J].Chin J Naut Med Hyper Med, 2010, 17(5): 261-265. [李欣, 吴姗珊, 孙涛, 等. 腹部开放伤后海水浸泡对实验犬胃屏障功能的影响[J]. 中华航海医学与高气压医学杂志, 2010, 17(5):261-265.]

[2]Haglund RA, Burleson KO, Kloner RA, et al. Reperfusion injury induces apoptosis in rabbit cardiomyocytes[J]. J Clin Invest,1994, 9(44): 1621-1628.

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[4]Li X, Yue X, Sun T, et al. Influence of seawater immersion of open abdominal wound on function and pathological changes in liver in dog[J]. Med J Chin PLA, 2007, 32(3): 268-273. [李欣,岳鑫, 孙涛, 等. 海水浸泡对腹部开放伤实验犬肝脏功能及形态学的影响[J]. 解放军医学杂志, 2007, 32(3): 268-273.]

[5]Morrissy S, Xu B, Aguilar D, et al. Inhibition of apoptosis by progesterone in cardiomyocytes[J]. Aging Cell, 2010, 9(5): 799-809.