果蝇蛋白质组学研究进展

邢晓华 ，杨晓明 ，徐平

1.北京工业大学 生命科学与生物工程学院，北京 100124；

2.军事医学科学院 放射医学研究所，北京 100850；3.北京蛋白质组研究中心，北京 102206

果蝇（Drosophila melanogaster）是一种双翅目（Diptera）昆虫，因喜好腐烂的水果及发酵的果汁而得名。由于个体小、繁殖快、生活史丰富、染色体少、突变多等一系列优点，果蝇已成为生命科学领域最常用的一种模式生物[1]。

果蝇是多细胞生物，具有复杂的发育过程和丰富的行为学特征，与人类在身体发育、神经退化、肿瘤形成等的调控机制上有很多相通之处，其调控规律也与人类极其相似，许多人类基因在果蝇上也有，甚至功能可以互通[2]。因此，在20世纪生命科学发展的历史长河中，果蝇扮演了十分重要的角色。遗传学、发育的基因调控、各类神经疾病、帕金森病、老年痴呆、药物成瘾和酒精中毒、衰老与长寿、记忆与某些认知行为的研究中都有果蝇的“身影”[3]。目前果蝇基因组方面的研究也已相当成熟。2000年，果蝇全基因组测序完成。该基因组中编码蛋白质的基因有13 600多个，数量少于线虫。但因果蝇存在复杂的生活史和形态变化，因此其基因的功能调控更为复杂多样。长期的系统研究也使果蝇的基因组成为至今注释最好的基因组之一[4]。另外，果蝇拥有目前国际上应用最广泛的在线数据库Flybase，利于对其蛋白质的功能和结构进行进一步的分析[5]。

尽管果蝇的研究在遗传学和基因组方面已非常成熟，但蛋白质是生命活动功能的直接承担者，在果蝇蛋白质组水平的研究可以直接获得基因在细胞内的确切功能，是系统鉴定、定量蛋白质，并研究其生物学功能的重要手段。最重要的是，在蛋白质组层面，果蝇作为无脊椎模式生物，在氨基酸序列水平与脊椎动物的同源性最高，结合果蝇的遗传学、基因组学及生理学研究技术基础，能够对其如此丰富且与人类极其相似的生活史调控规律进行深度解读[6]。因此，果蝇蛋白质组学研究引起了生命科学界的广泛重视，成为当今国际生命科学和生物技术领域最活跃的学科前沿。

但由于技术的限制，至今在果蝇蛋白质组学方面的研究报道并不多见。我们对近年来的果蝇蛋白质组学研究进行了综述，主要包括果蝇蛋白质组的产生背景，以及在表达谱、修饰谱、比较蛋白质组学和疾病模型蛋白质组学等方面的进展，并对果蝇蛋白质组学的发展前景进行了展望，为进一步开展人类疾病模型的果蝇蛋白质组学研究奠定基础。

1 果蝇及其蛋白质组的研究内容

果蝇的生活史包括卵、幼虫、蛹、成虫等4个连续的但形态完全不同的变态发育阶段。其生活周期十分短暂，在25℃、60%相对湿度条件下约为10 d。通过控制养殖温度，可以加速或减缓果蝇的发育。果蝇个体很小，成虫果蝇体长仅为3～4 mm，且雄性较雌性偏小。果蝇的染色体数目少，其核型只包括4对同源染色体，其中1对为性染色体，3对为常染色体。果蝇的性别决定方式为XY型，雄性异配，因此常常被用作验证性别决定的实验素材[7]。

基于清晰的遗传背景和便捷的遗传操作，果蝇在发育生物学、生物化学、分子生物学等领域都占据了不可替代的位置，在神经科学领域也得到越来越广泛的应用。随着现代分子生物学技术的日臻成熟，对果蝇的研究已远远不止停留在基因和遗传学的层次上，科学家更关注果蝇基因如何调控蛋白质的表达，并进而对生命活动进行直接调控，揭示人类生命的奥秘。

随着人类基因组学计划的逐渐成熟，分子水平的实验技术不断发展，果蝇蛋白质组学研究的各个方面均有较大突破，新的研究内容和方法不断出现。

2 果蝇蛋白质组表达谱

基于凝胶电泳体系的蛋白质鉴定策略是近年来果蝇蛋白质组学研究常用的技术策略，主要包括2种技术：一是基于2-DE的传统的蛋白质组学研究方法，二是基于一维凝胶电泳分离-高效液相色谱分离和串联质谱技术（GeLC-MS/MS）的蛋白质组学研究策略。但由于技术的限制，果蝇蛋白质组学研究，尤其是大规模的蛋白质组学研究报道尚不多见。为得到覆盖率更高的果蝇蛋白质组表达谱，各种新方法不断产生，比较有效的是将样品分为不同的组织和器官分别进行鉴定，不但可以提高鉴定率，也可以为研究特定组织和器官提供更为详尽的蛋白信息，实现生物功能专一性和多样性（表1）。

2.1 基于2-DE的传统的蛋白质组学研究方法

基于2-DE的传统的蛋白质组学研究方法在前期的果蝇蛋白质组学研究中占据主要地位。Alonso等[8]利用2-DE技术研究了果蝇线粒体的蛋白质组，鉴定到231个银染的多肽，对应了66个线粒体蛋白质；并且用相似的技术体系对果蝇成虫的翅膀胎盘进行了蛋白质组分析，共鉴定到1492个多肽，对应了100多个蛋白[9]。Vierstraete等[10]利用该技术对果蝇幼虫血淋巴的分泌蛋白质组进行了分析，分别得到脂多糖、啤酒酵母和藤黄微球菌等3种物质感染下发生免疫的蛋白质10、20和19个。Takemori等[11]用相似的技术体系发现了440个果蝇雄性生殖系统（包括睾丸、精囊、附属腺、射精管和射精管球）组织特异的蛋白。Lee等[12]利用双向电泳技术鉴定了果蝇头部中的1500个荧光蛋白点，得到650个蛋白质，其中500个属于果蝇头部特异的蛋白质。

双向电泳可分离上千种蛋白质，并获得该蛋白的等电点和相对分子质量，但也存在不易分离强疏水性、低溶解度、极酸或极碱的蛋白质，以及繁琐、不稳定、灵敏度低等缺点[13-14]。

表1 以果蝇为模式生物的蛋白质组表达谱研究进展

2.2 基于高效液相色谱分离和串联质谱技术的蛋白质组学

近几年中，基于高效液相色谱分离和串联质谱技术的蛋白质组学逐渐成为主流的全蛋白质组研究方法。Bunner等[15]报道了基于LC-MS/MS蛋白质组技术的首例大规模果蝇蛋白质组学研究成果，选取果蝇卵、幼虫、蛹和成虫等4个发育阶段及Kc167和S2等2个细胞系作为研究材料，在多种蛋白提取分离鉴定技术的支持下，经若干次重复试验，共鉴定到9124个蛋白，对应8672个基因，成为迄今最大规模的果蝇蛋白质组研究。

组织特异和亚细胞水平的蛋白质组学研究是蛋白质组学领域中的一支新生力量。它一方面降低样品的复杂度，使分析简单化；另一方面可以相对富集相应亚细胞结构的低丰度蛋白，而且可以部分提示蛋白质的定位和功能信息，成为蛋白质鉴定及其功能研究的纽带。由于果蝇这个多细胞生物的复杂的发育过程、丰富的行为学特征及不断改进的多种策略和技术方法，其亚细胞蛋白质组学研究进展非常迅速，一些重要的亚细胞结构的蛋白质组不断得到分析，并已深入到亚细胞器和复合体水平。Was⁃brough等[16]利用LC-MS/MS的方法分离分析了果蝇精子蛋白质组，获得了包含956个精子相关蛋白的数据集。Muller等[17]分析了果蝇胚胎中心体的蛋白质组学研究，共鉴定到蛋白251个。Khanna等[18]利用相似方法研究了质膜蛋白质组，鉴定了432个蛋白。Cammarato等[19]也利用该方法对145个果蝇心脏组织进行蛋白质组分离分析，共鉴定了1228个相关蛋白质。不但如此，亚细胞蛋白质组还向更深方向发展。Anholt等[20]以果蝇触角为研究材料，初步探索了果蝇的可溶性蛋白质组，发现了100多个相关蛋白。这些有益的尝试都加深了我们对蛋白质在特异组织及细胞内的特异表达、转运、定位及其生物学功能的理解。

3 果蝇蛋白质组修饰谱

蛋白质翻译后修饰在生命活动中起着十分重要的作用，它使蛋白质的结构更为复杂、功能更为完善、调节更为精细、作用更为专一。研究较多的果蝇的蛋白质翻译后修饰形式主要是磷酸化、泛素化、糖基化、类泛素化及组蛋白的甲基化。在体内，各种翻译后修饰过程不是孤立存在的，而是相互作用、共同调节的。

3.1 磷酸化修饰

蛋白质磷酸化修饰涉及细胞信号传导、神经活动、肌肉收缩及细胞的增殖、发育和分化等生理、病理过程，在生命活动发展中发挥着巨大的作用。Zhai等[21]利用一套完整的磷酸化富集和鉴定体系，包括强阳离子交换色谱、金属离子亲和色谱和高精度的质谱体系，在果蝇的胚胎中共鉴定到13 720个磷酸化位点，来自2702个蛋白，建立了当时规模最大的果蝇磷酸化数据集。在果蝇的蛋白质磷酸化修饰的蛋白质组学研究中，人们致力于不断提高磷酸肽的富集效率和质谱的鉴定水平，以此提高果蝇蛋白质组的磷酸化修饰谱。Pinkse等[22]利用基于二氧化钛富集的二维色谱方法，使果蝇S2细胞系的磷酸肽鉴定量与仅借助SCX相比翻了4番，高达2152个，大大加强了磷酸肽的富集效果。Bodenmiller等[23]不但通过改进磷酸肽的富集方式将果蝇Kc167细胞系的磷酸肽的鉴定从299提高到494个，并且经MS3质谱谱图的确认，提高了鉴定的可信度，也将磷酸化肽的鉴定数目提高到505个，其中25个蛋白（5%）都是这种新方法单独鉴定的结果。这一尝试使果蝇的磷酸化蛋白质组学研究有了巨大飞跃。另外通过将ETD和CID结合，进一步提高了果蝇Kc167细胞系磷酸化肽的鉴定率，其中ETD单独鉴定了153个磷酸肽。这与提高磷酸肽富集效率的方法异曲同工，对果蝇修饰蛋白质组的鉴定做出了巨大贡献[24]。Courcelles等[25]发明了一种算法，可以鉴定磷酸肽的同分异构体，在果蝇的磷酸化蛋白质组鉴定中共得到15 700个磷酸肽，证明了在LC-MS的洗脱层面有8%～12%的磷酸肽都含有同分异构体。

3.2 泛素化和类泛素化修饰

蛋白质泛素化和类泛素化修饰对于蛋白质的定位、代谢、功能、调节和降解起着重要作用。随着蛋白质翻译后修饰研究的不断深入，蛋白质泛素化的新的功能不断被挖掘，包括参与细胞周期、增殖、凋亡、分化、转移、基因表达、转录调节、信号传递、损伤修复、炎症免疫等几乎一切生命活动的调控，并且在肿瘤、心血管等疾病发病中起十分重要的作用，是近年来生物化学研究的一项重大成果，亦是研究、开发新药物的新靶点。Franco等[26]利用蛋白质组学策略，在果蝇的胚胎细胞中鉴定到48个神经细胞特异的泛素化底物。更为重要的是，这些泛素化底物都是首次被鉴定到，并且没有任何同源的蛋白质具有泛素化的证据，说明这种蛋白质组学方法鉴定的神经细胞的泛素化底物并不与其他细胞类型共有。Nie等[27]在果蝇的早期胚胎细胞中鉴定到140个早期类泛素化底物，并且验证了这些底物分别参与细胞周期调控、Ras信号通路和早期形体形成过程。类泛素化蛋白质组学数据集的产生，为以后研究类泛素化的功能提供了便利。Xu等[28]发展了一种果蝇近乎全标记的SILAC方法，并发现果蝇在成虫期随年龄的增长K48和K63泛素链具有不同的变化趋势，表明蛋白质的泛素化及其状态和生物寿命相关。

3.3 组蛋白修饰

组蛋白上的翻译后修饰主要有4种情况，即乙酰化、磷酸化、甲基化和ADP-核糖基化。甲基化和乙酰化与转录调节有关，特别是组蛋白乙酰化对于哺乳动物生物钟的调控是非常重要的[29]。Ardehali等[30]通过多线染色体染色和活细胞成像技术，首次发现了一种位于启动子区域的负责组蛋白H3K4三甲基化的蛋白dSet1。该蛋白依赖的H3K4三甲基化负责染色体结构的形成，并保证RNA聚合酶Ⅱ的合成供给，进而完成对转录活性的调节。

Imhof等[31]发现组蛋白H1的修饰形式随多细胞生物的不同生长阶段而变化。以果蝇胚胎为例，S10期的H1单磷酸化丰度明显比胚胎期的少，说明翻译后修饰与细胞周期和细胞分化相关。这是首次在果蝇中进行组蛋白的翻译后形式的鉴定，为后续研究提供了依据。

乙酰化对基因表达的调控已广为人知。这一新的研究更让人们确定组蛋白的乙酰化对基因表达的调控具有广泛的作用[32]，而果蝇可以作为很好的模型来验证这一论断，进而推动组蛋白修饰在生命发展过程中发挥更加积极的作用。

4 果蝇比较蛋白质组

蛋白质组具有动态、多样和时空特异性。即使在细胞发育的不同阶段，因不同时期、不同条件，蛋白质组的构成也不断地变化。因此，分析比较不同条件下蛋白质组的变化和差异，发现和鉴定在不同生理条件下蛋白质组中的差异组分，从中揭示生命的奥秘，这些构成了比较蛋白质组学的研究内容。然而，比较蛋白质组学研究由于并不要求捕获“全部”蛋白，而重在找出有意义的差异蛋白，因而在技术上有着相当高的可实现性。目前常用的方法主要分为有标定量（labeling quantitation）和无标定量（la⁃bel-free quantitation）2类。有标定量又可分为化学标记方法［如同位素标记的亲和标签（isotope-cod⁃ed affinity tag，ICAT）、串联质谱标签（tandem mass tag，TMT）、同位素相对标记与绝对定量技术（isobar⁃ic tagging for relative and absolute quantitation，iTRAQ）］和代谢标记方法［（细胞培养氨基酸稳定同位素标记（stable isotope labeling with amino acids in cell culture，SILAC）、15N代谢标记方法］[33]。目前果蝇中应用较广泛的有15N标记、SILAC、iTRAQ及无标定量方法。

4.1 15N标记方法

2003年Krijgsveld等[34]首次提出了果蝇全蛋白质组的代谢标记策略。用只含15N的培养基标记酵母，再以此喂养生长在以这些标记酵母为惟一氮源的培养基中的果蝇卵，经质谱鉴定发现15N的标记效率约为95%，证明果蝇可通过1个世代得到几乎完全的标记。Findlay等[35]利用该技术研究了果蝇交配时精液蛋白对生殖的影响，发现了19个原先没有注释的基因。这种代谢标记和非标记果蝇可在蛋白样品抽提前混合，因此可以极大地减少样品操作过程引起的误差。缺点是不同肽中标记的氮原子数目不同，致使标记与非标记肽的相对分子质量位移在鉴定前不能预测，且标记肽段形成宽泛的同位素峰分布，增加了蛋白质鉴定中的假阳性率和定量的难度。

4.2 SILAC标记方法

与15N标记方法不同，SILAC标记是利用重稳定性同位素标记的氨基酸在生长过程中对目标蛋白质组进行标记。这种标记和非标肽段的相对分子质量位移是可以提前预测的，并且随后的蛋白质分离、酶切、鉴定等所有过程都在同一条件下进行，误差小，重复性好，因此逐渐取代15N标记方法而成为现阶段同位素代谢标记的金标准[37]。Bonaldi等[38]利用ISWI基因缺陷型果蝇模型和对照组的SILAC方法标记果蝇SL2细胞系，用LTQ-Orbitrap质谱仪鉴定到4119个蛋白，同时得到了因ISWI基因表达水平的改变而引起的几百个在转录组和蛋白质组水平表达产生显著差异的蛋白。Sury等[39]报道，在果蝇中SILAC标记的效率可以达到近100%，为果蝇的SILAC标记提供了更广阔的应用空间。Xu等[28]也利用赖氨酸重标酵母的方法对果蝇进行了近乎完全的标记，并在果蝇的泛素化蛋白质组研究中得到良好的应用，为果蝇翻译后修饰蛋白质组的研究奠定了坚实基础。

4.3 ICAT标记方法

ICAT是由Gygi等[40]开发的一种同位素亲和标签标记和定量蛋白质组学研究策略。该方法通过在蛋白水平分别加入不同标记的ICAT试剂，反应后等比例混合进行消化和质谱分析。实践表明ICAT试剂存在一些不足，如不能分析半胱氨酸缺失的蛋白质、标记和非标记肽不能被同步洗脱、难于精确定量等。另外，ICAT标签试剂本身的相对分子质量约为500，增加了谱图和数据库搜索的复杂性。为解决这些技术上的缺陷，先后又开发了可剪切ICAT（cleav⁃able ICAT，cICAT）试剂，用可被酸剪切的官能团代替ICAT试剂中的聚醚链接，以此减少难以解析的碎片离子数量；以9个13C取代8个氘原子，使轻、重同位素试剂相对分子质量相差9，不仅便于质谱分辨不同分子质量的标签，而且使得轻、重肽段可被色谱共洗脱，有效提高了定量精度。Kohler等[41]用cICAT标记方法检测了普通幼虫期果蝇和饥饿状态下的脂肪体蛋白质的表达变化，监测到脂肪脱氢酶Desat1缺失时果蝇幼虫细胞在丧失饥饿状态下的自我吞噬的功能，首次揭示了Desat1在脂滴形成和自体吞噬中的作用。这种cICAT标记试剂的缺点是合成成本太高，难以普及使用。

4.4 iTRAQ标记方法

iTRAQ标记是化学标记的一种，可同时标记并比较8种不同样本，提高了分析通量。Pflieger等[42]使用iTRAQ技术对蛋白磷酸酶处理后果蝇细胞系进行研究，通过比较蛋白质的磷酸化状态，发现了胰岛素受体的同源序列Chico。Pedersen等[43]为了检测果蝇中的温度敏感致死因子，采用iTRAQ技术对实验组、近交系对照组和远交系对照组进行不同的化学标签标记，经二维液相色谱-串联质谱分析，共鉴定到45个在实验组和近交系对照组发生了明显变化的可能的温度敏感蛋白，这些蛋白在近交系和远交系对照组中并没有发生显著的量的变化，进一步证明了这些温度敏感差异蛋白的真实性。但这种标记方法要求对比较的蛋白组必须进行提取、蛋白酶消化和脱盐处理等多个步骤，然后才能进行标记、混合和质谱鉴定、定量。这会引入试验误差，增加了发现真实的生物学差异蛋白的难度。

4.5 无标定量方法

无标定量方法不进行任何标记，而是直接利用质谱鉴定中产生的数据，比如样品酶切后经LC-MS/MS产生的质谱数据对蛋白样品进行定量比较。这种方法简便易行，在果蝇定量蛋白质组学研究上也得到了广泛应用。Xun等[44]利用该方法分析了帕金森病果蝇模型的蛋白质组，在A53T α-突触核蛋白果蝇模型中鉴定、定量了253个蛋白，并在重叠区域筛选到24个表达差异蛋白。这些蛋白主要与膜、内质网、肌动蛋白细胞骨架、线粒体和核糖体相关。Xun等[45]将无标定量和广泛型内标技术相结合，定量了青少年型帕金森病果蝇模型（AR-JP），共定量了375个蛋白。其中16个蛋白具有显著的表达差异，参与能量代谢的失调蛋白有7个，并有6个表达下调，说明青少年型帕金森病和能量代谢有较高的关联性；参与蛋白转运活动的5个蛋白均表现出较高的水平，如幼虫血清蛋白1α、1β、1γ和脂肪体蛋白1均显示出高于10倍的上调水平。尽管同位素标记已成为可信赖的定量方法，但准备同位素化合物需大量时间，并且试剂昂贵，难以推广，而非标定量法不存在这些缺点，应用前景广阔。但非标定量法对样品制备和分析过程的控制要求较高，否则难以得到可信的结果。

5 果蝇疾病模型蛋白质组

近一个世纪以来，果蝇作为生命科学领域的一种理想的模式生物，在生物学研究的舞台上占有举足轻重的地位。十几年前完成的果蝇的基因组测序结果显示，超过60%的人类疾病基因在果蝇的基因组中有直系同源物，其中人类的肿瘤、神经疾病、畸形综合征等相关基因多与果蝇基因同源。因此，以果蝇为模式研究人类疾病的发病机制有非常重要的意义[46]。

Xun等[47]利用液相色谱和质谱联用技术，对A30P α-突触核蛋白转基因果蝇和对照的早期帕金森病果蝇模型进行了蛋白质组研究，结果显示约44%的基因在转录水平和蛋白质水平均发生了改变，但变化趋势不完全一致。蛋白质组研究弥补了转录本研究的不足，对后期疾病状态的预测有较大的帮助。他们在该研究中还发现，早期的细胞骨架和线粒体差异蛋白主要与神经退化相关。

Beller等[49]比较了野生型和脂肪储存缺陷型果蝇的脂肪滴成分的差异，在鉴定到的248个蛋白中，除了发现与脂肪滴相关的PAT蛋白外，还鉴定了参与蛋白质胞内定位和多层面转运的一些相关蛋白。Li等[50]利用2-DE技术研究了经饮食抑制剂BBI处理后果蝇胚胎中肠蛋白质组的变化，发现了9种表达差异蛋白，例如固醇载体蛋白SCPX参与了脂肪酸代谢过程。脂滴和脂肪酸代谢直接介导肝脏脂质代谢，是肝病发生和发展的主要成因，这为人类肝脏疾病的研究提供了依据。

Chan等[51]利用果蝇模型研究了VCP基因引起的额颞叶痴呆病（IBMPFD）的比较蛋白质组。利用2D-DIGE方法在转基因果蝇模型中鉴定了43个蛋白点，并发现VCP的突变消耗了大量ATP，为节约能量，导致肌动蛋白关闭，由此激活ROS信号通路，进而引发细胞凋亡。这是蛋白质组学在探索IBMPFD分子机制方面的新发现，为发病机理的研究和治疗靶点的寻找提供了有力证据。

6 结语

利用果蝇进行遗传学研究的历史悠久，对其染色体组成、编码基因、蛋白质定位和表型等的详细阐明都是其他生物无法比拟的。百余年的研究也积累了很多果蝇的相关知识与信息，制备了大量分布于数以千计的基因中的突变体，为构建果蝇的各种疾病模型奠定了基础。随着蛋白质组学技术的发展，果蝇还将继续作为重要的模式生物被广泛用于生命科学的各个研究领域。这为开展与疾病相关的临床蛋白质组学（clinical proteomics）研究，揭示生命的奥秘和疾病发生发展的分子机制奠定坚实的基础。

[1]Beller M,Oliver B.One hundred years of high-throughput Drosophila research[J].Chromosome Res,2006,14(4):349-362.

[2]Bier E.Drosophila,the golden bug,emerges as a tool for hu⁃man genetics[J].Nat Rev Genet,2005,6(1):9-23.

[3]Chien S,Reiter L T,Bier E,et al.Homophila:human dis⁃ease gene cognates in Drosophila[J].Nucleic Acids Res,2002,30(1):149-151.

[4]Adams M D,Celniker S E,Holt R A,et al.The genome se⁃quence of Drosophila melanogaster[J].Science,2000,287(5461):2185-2195.

[5]Grumbling G,Strelets V.FlyBase:anatomical data,images and queries[J].Nucleic Acids Res,2006,34(Database issue):D484-D488.

[6]Mushegian A R,Garey J R,Martin J,et al.Large-scale taxo⁃nomic profiling of eukaryotic model organisms:a comparison of orthologous proteins encoded by the human,fly,nematode,and yeast genomes[J].Genome Res,1998,8(6):590-598.

[7]Venken K J,Bellen H J.Emerging technologies for gene ma⁃nipulation in Drosophila melanogaster[J].Nat Rev Genet,2005,6(3):167-178.

[8]Alonso J,Rodriguez J M,Baena-Lopez L A,et al.Character⁃ization of the Drosophila melanogaster mitochondrial proteome[J].J Proteome Res,2005,4(5):1636-1645.

[9]Alonso J,Santaren J F,Proteomic analysis of the wing imagi⁃nal discs of Drosophila melanogaster[J].Proteomics,2005,5(2):474-489.

[10]Vierstraete E,Verleyen P,De Loof A,et al.Differential pro⁃teomics for studying Drosophila immunity[J].Ann N Y Acad Sci,2005,1040:504-507.

[11]Takemori N,Yamamoto T T.Proteome mapping of the Dro⁃sophila melanogaster male reproductive system[J].Proteomics,2009,9(9):2484-2493.

[12]Lee T R,Huang S H,Lee C C,et al.Proteome reference map of Drosophila melanogaster head[J].Proteomics,2012,12(11):1875-1878.

[13]Tannu N S,Hemby S E.Two-dimensional fluorescence differ⁃ence gel electrophoresis for comparative proteomics profiling[J].Nat Protoc,2006,1(4):1732-1742.

[14]Iwadate Y.Clinical proteomics in cancer research-promises and limitations of current two-dimensional gel electrophoresis[J].Curr Med Chem,2008,15(23):2393-2400.

[15]Brunner E,Ahrens C H,Mohanty S,et al.A high-quality catalog of the Drosophila melanogaster proteome[J].Nat Bio⁃technol,2007,25(5):576-583.

[16]Wasbrough E R,Dorus S,Hester S,et al.The Drosophila me⁃lanogaster sperm proteome-II(DmSP-II)[J].J Proteomics,2010,73(11):2171-2185.

[17]Muller H,Schmidt D,Steinbrink S,et al.Proteomic and func⁃tional analysis of the mitotic Drosophila centrosome[J].EMBO J,2010,29(19):3344-3357.

[18]Khanna M R,Stanley B A,Thomas G H.Towards a mem⁃brane proteome in Drosophila:a method for the isolation of plasma membrane[J].BMC Genomics,2010,11:302.

[19]Cammarato A,Ahrens C H,Alayari N N,et al.A mighty small heart:the cardiac proteome of adult Drosophila melano⁃gaster[J].PLoS One,2011,6(4):e18497.

[20]Anholt R R,Williams T I.The soluble proteome of the Dro⁃sophila antenna[J].Chem Senses,2010,35(1):21-30.

[21]Zhai B,Villen J,Beausoleil S A,et al.Phosphoproteome anal⁃ysis of Drosophila melanogaster embryos[J].J Proteome Res,2008,7(4):1675-1682.

[22]Pinkse M W,Mohammed S,Gouw J W,et al.Highly robust,automated, and sensitive online TiO2-based phosphopro⁃teomics applied to study endogenous phosphorylation in Dro⁃sophila melanogaster[J].J Proteome Res,2008,7(2):687-697.

[23]Bodenmiller B,Malmstrom J,Gerrits B,et al.PhosphoPep--a phosphoproteome resource for systems biology research in Dro⁃sophila Kc167 cells[J].Mol Syst Biol,2007,3:139.

[24]Domon B,Bodenmiller B,Carapito C,et al.Electron transfer dissociation in conjunction with collision activation to investi⁃gate the Drosophila melanogaster phosphoproteome[J].J Pro⁃teome Res,2009,8(6):2633-2639.

[25]Courcelles M,Bridon G,Lemieux S,et al.Occurrence and de⁃tection of phosphopeptide isomers in large-scale phosphopro⁃teomics experiments[J].J Proteome Res,2012,11(7):3753-3765.

[26]Franco M,Seyfried N T,Brand A H,et al.A novel strategy to isolate ubiquitin conjugates reveals wide role for ubiquitina⁃tion during neural development[J].Mol Cell Proteomics,2011,10(5):M110 002188.

[27]Nie M,Xie Y,Loo J A,et al.Genetic and proteomic evi⁃dence for roles of Drosophila SUMO in cell cycle control,Ras signaling,and early pattern formation[J].PLoS One,2009,4(6):e5905.

[28]Xu P,Tan H,Duong D M,et al.,Stable isotope labeling with amino acids in Drosophila for quantifying proteins and modifications[J].J Proteome Res,2012,11(9):4403-4412.

[29]Boros I M.Histone modification in Drosophila[J].Brief Funct Genomics,2012,11(4):319-331.

[30]Ardehali M B,Mei A,Zobeck K L,et al.Drosophila Set1 is the major histone H3 lysine 4 trimethyltransferase with role in transcription[J].EMBO J,2011,30(14):2817-2828.

[31]Villar-Garea A,Imhof A.Fine mapping of posttranslational modifications of the linker histone H1 from Drosophila mela⁃nogaster[J].PLoS One,2008,3(2):e1553.

[32]Xiong Y,Guan K L.Mechanistic insights into the regulation of metabolic enzymes by acetylation[J].J Cell Biol,2012,198(2):155-164.

[33]Li Z,Adams R M,Chourey K,et al.Systematic comparison of label-free,metabolic labeling,and isobaric chemical label⁃ing for quantitative proteomics on LTQ Orbitrap Velos[J].J Proteome Res,2012,11(3):1582-1590.

[34]Krijgsveld J,Ketting R F,Mahmoudi T,et al.Metabolic label⁃ingofC.elegansand D.melanogasterforquantitativepro⁃teomics[J].Nat Biotechnol,2003,21(8):927-931.

[35]Findlay G D,Yi X,Maccoss M J,et al.Proteomics reveals novel Drosophila seminal fluid proteins transferred at mating[J].PLoS Biol,2008,6(7):e178.

[36]Ong S E,Blagoev B,Kratchmarova I,et al.Stable isotope la⁃beling by amino acids in cell culture,SILAC,as a simple and accurate approach to expression proteomics[J].Mol Cell Proteomics,2002,1(5):376-386.

[37]Ong S E,Mann M.A practical recipe for stable isotope label⁃ing by amino acids in cell culture(SILAC)[J].Nat Protoc,2006,1(6):2650-2660.

[38]Bonaldi T,Straub T,Cox J,et al.Combined use of RNAi and quantitative proteomics to study gene function in Drosoph⁃ila[J].Mol Cell,2008,31(5):762-772.

[39]Sury M D,Chen J X,Selbach M.The SILAC fly allows for accurate protein quantification in vivo[J].Mol Cell Proteomics,2010,9(10):2173-2183.

[40]Gygi S P,Rist B,Gerber S A,et al.Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags[J].Nat Biotechnol,1999,17(10):994-999.

[41]Kohler K,Brunner E,Guan X L,et al.A combined pro⁃teomic and genetic analysis identifies a role for the lipid de⁃saturase Desat1 in starvation-induced autophagy in Drosophila[J].Autophagy,2009,5(7):980-990.

[42]Pflieger D,Junger M A,Muller M,et al.Quantitative pro⁃teomic analysis of protein complexes:concurrent identification of interactors and their state of phosphorylation[J].Mol Cell Proteomics,2008,7(2):326-346.

[43]Pedersen K S,Codrea M C,Vermeulen C J,et al.Proteomic characterization ofa temperature-sensitive conditionallethal in Drosophila melanogaster[J].Heredity(Edinb),2010,104(2):125-134.

[44]Xun Z,Sowell R A,Kaufman T C,et al.Quantitative pro⁃teomics of a presymptomatic A53T alpha-synuclein Drosophi⁃la model of Parkinson disease[J].Mol Cell Proteomics,2008,7(7):1191-203.

[45]Xun Z,Kaufman T C,Clemmer D E.Stable isotope labeling and label-free proteomics of Drosophila parkin null mutants[J].J Proteome Res,2009,8(10):4500-4510.

[46]Rubin G M,Yandell M D,Wortman J R,et al.Comparative genomics of the eukaryotes[J].Science,2000,287(5461):2204-2215.

[47]Xun Z,Sowell R A,Kaufman T C,et al.Protein expression in a Drosophila model of Parkinson's disease[J].J Proteome Res,2007,6(1):348-357.

[48]Xun Z,Sowell R A,Kaufman T C,et al.Lifetime proteomic profiling of an A30P alpha-synuclein Drosophila model of Par⁃kinson's disease[J].J Proteome Res,2007,6(9):3729-3738.

[49]Beller M,Riedel D,Jansch L,et al.Characterization of the Drosophila lipid droplet subproteome[J].Mol Cell Proteomics,2006,5(6):1082-1094.

[50]Li H M,Margam V,Muir W M,et al.Changes in Drosophi⁃la melanogaster midgut proteins in response to dietary Bow⁃man-Birk inhibitor[J].Insect Mol Biol,2007,16(5):539-549.

[51]Chan H T,Lee T R,Huang S H,et al.Proteomic analysis of a drosophila IBMPFD model reveals potential pathogenic mechanisms[J].Mol Biosyst,2012,8(6):1730-1741.