靶向c-Raf-1基因的反义核酸抗乙型肝炎病毒活性研究

黄海 ，张秀娟 ，谢佩雯 ，王学军 ，王升启

1.河南中医学院，河南 郑州 450003；2.军事医学科学院 放射与辐射医学研究所，北京 100850

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染严重影响人类健康。目前，治疗乙肝病毒的药物主要有2大类，即干扰素和核苷类似物，但这2类药物仍然存在不同程度的副作用且均不能彻底清除HBV，尤其对HBV表面抗原（hepatitis B surface protein，HBsAg）的清除作用微弱，而HBsAg的表达是造成HBV免疫耐受的关键因素之一[1]。因此，寻找能抑制HBsAg的药物将是未来抗HBV治疗的重中之重。

寻找病毒和宿主之间的相互作用关系并发现有效的抗病毒药物靶点，是当前病毒学研究的重点和热点，治疗方法从传统的靶向病毒向靶向宿主基因发展已成为一种新趋势，并且在许多抗病毒治疗探索中均取得了重要进展[2-5]。HBV感染是引起人类肝细胞癌的重要潜在致病因子。HBV基因组中具有转录激活活性的HBx蛋白，可引发c-Raf-1/MEK激酶级联反应[6]，促进HBV的表达，致使细胞增殖周期失调，进而形成肿瘤。众多研究数据表明，宿主基因c-Raf-1参与了HBV在肝细胞内的复制[7]，并且c-Raf-1的活化在肝癌的发展中也起重要作用[8]。这就提示我们c-Raf-1基因可能是抗HBV药物设计的潜在作用靶点，抑制c-Raf-1可能起到抗HBV复制及其疾病进程的作用。

反义核酸（antisense oligonucleotide）是根据碱基互补原理，利用一段特异互补的DNA或RNA片段抑制或封闭特定基因表达的一门技术，是在mRNA水平干扰基因功能，开发新药的一种方法[9]。我们通过设计并筛选能特异性抑制c-Raf-1基因的反义核酸，验证通过干扰c-Raf-1基因的功能是否具有抑制HBV表达的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

4～5周龄C57/BL6雄性小鼠购自军事医学科学院动物实验中心；HBV稳定转染细胞HepG2.2.15由本实验保存，在含10%胎牛血清（FBS，Hyclone公司）、380 μg/mL G418的DMEM细胞培养液［M&C Gene Technology（Beijing）Ltd.］中，于 37℃、5%CO2条件下培养；GenJet Ver.II转染试剂购自SignaGen公司；HBsAg及乙肝e抗原（HBeAg）定性检测试剂盒购自上海科华有限公司；HBsAg及HBeAg定量检测试剂盒购自北京泰格有限公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）试剂盒购自日本同仁化学研究所（Dojin⁃do）；反转录试剂盒购自北京天根生化科技公司；TRIzol购自Invitrogen公司。

1.2 靶向c-raf-1基因反义核酸的设计

根据GenBank中人和小鼠c-raf-1基因mRNA序列（人：NM_002880；小鼠：NM_029780）的同源区，用 Antisense Design软件（http://sfold.wadsworth.org）进行基于RNA二级预测结构的计算机辅助反义核苷酸设计，通过GenBank联机BLAST比对，保证所选择的靶序列具有较好的特异性，设计并合成3条靶向 c-raf-1 的反义核苷酸 Raf-565（5′-TTGCTTGTC TTAGAAGGATC-3′）、Raf-943（5′-TAGTAGGTACT TTGGTGCTA-3′）和 Raf-3145（5′-AAACCTGTATT CCTGGCTTC-3′）。

1.3 脂质体介导瞬时转染寡核苷酸

将生长状态良好的HepG2.2.15细胞分别按7×103/孔接种于96孔板，每个实验组设置3个重复孔。细胞于37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养12～24 h，待细胞达到60%～70%融合时，参照SignaGen公司GenJet Ver.II转染试剂操作说明进行转染，将脂质体和寡核苷酸按3∶1的体积质量比混匀，每孔转染的反义核酸体积为 100 μL，终浓度为 0.4 μmol/L。同时设立转染试剂对照组，转染8 h后去除含脂质体-寡核苷酸的转染液，用含10%FBS的DMEM正常培养液继续培养，转染96 h后收集细胞培养液，检测HBsAg和HBeAg的表达。

1.4 细胞上清HBsAg和HBeAg的检测

收集细胞上清，按照HBsAg和HBeAg的ELISA检测试剂盒说明书操作步骤进行。即取50 μL细胞培养液加入包被有HBsAg或HBeAg抗体的96孔板中，每孔加入50 μL的HBsAg或HBeAg对应的酶标结合物，封板，振荡混匀，于37℃温箱孵育30 min，手工洗板5次，加入显色液A和B，封板，振荡混匀，于37℃温箱孵育15 min，加终止液50 μL，振荡混匀，酶标仪上测定D450nm值。

1.5 反义核酸细胞毒性检测

分 别 以 0.4、0.8、1.6、3.2 μmol/L 的 浓 度 转 染HepG2.2.15细胞，每个药物做3个复孔，同时设立转染试剂对照组（按最高剂量），参照SignaGen公司GenJet Ver.II转染试剂操作说明进行转染，将脂质体和寡核苷酸按3∶1的体积质量比混匀，每孔转染的反义核酸体积为 100 μL，终浓度为 0.4 μmol/L。转染8 h后换正常细胞培养液（含10%FBS的DMEM细胞培养液）继续培养，转染96 h后按照CCK-8说明书检测反义核酸的细胞毒性，细胞加入CCK-8后于37℃孵育箱中孵育0.5～1 h，酶标仪上测定D450nm值。

1.6 RT-PCR检测c-Raf-1基因mRNA水平

反义核酸 Raf-3145分别以 0.4、0.8、1.6 μmol/L的浓度转染HepG2.2.15细胞，并设正义序列（1.6 μmol/L，5′-TTTGGACATAAGGACCGAAG-3′）、随机序 列（1.6 μmol/L，5′-CGGTACAGCCGTTCAATCG A-3′）和转染试剂对照组（按最高剂量）。转染8 h后换正常细胞培养液（含10%FBS的DMEM细胞培养液），37℃、5%CO2继续培养。转染96 h后用TRIzol RNA提取试剂盒提取HepG2.2.15细胞总RNA，并取 1～2 μg RNA 作为模板，加入 2 μL 5×cDNA缓冲液及无RNase的ddH2O 6 μL，于42℃孵育 3 min，再将其与 2 μL 10×Fast RT 缓冲液、1 μL RT Enzyme Mix和2 μL RQ-RT Primer Mix混合，42℃孵育15 min，95℃孵育3 min，得到cDNA。参照GenBank中人c-Raf-1的基因序列设计PCR引物进行扩增，同时以GAPDH作为内参对照。c-Raf-1基因上游引物为5′-AAGATGCCGTGTTTG ATGGC-3′，下 游 引 物 为 5′-ATCCTGGAAACAGAC TCTCG-3′；GAPDH 上 游 引 物 为 5′-GCGGGAAATC GTGCGTGACATT-3′，下游引物为 5′-GATGGAGTT GAAGGTAGTTTCGTG-3′[10]。 PCR 反 应 体 系 包 括2.5 ng cDNA，Taq酶（TaKaRa公司）0.25 μL，10×PCR缓冲液5 μL，dNTP混合液4 μL，上、下游引物各 1 μL，灭菌蒸馏水 35 μL。PCR 反应条件：94℃30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30个循环。取PCR产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳。

1.7 反义核酸体内药效学评价

取4～5周龄C57/BL6雄性小鼠50只，每只尾静脉注射相当于体重10%的PBS和6 μg pHBV1.18质粒[11]，在 5～8 s内注射完毕，2 d 后检测 HBsAg和HBeAg的表达，并分为模型对照组和3个给药组（剂量分别为 30、10、3 mg/kg），每组10只；腹腔注射隔天给药，给药容积0.2 mL，对照组注射0.2 mL PBS，检测体重变化；分别于第 2、8、14、21、28、42 d尾静脉取血，取 10 μL 血与 190 μL PBS 混匀，5000 r/min离心5 min取上清，定量检测HBsAg和HBeAg的含量。按化学发光检测试剂盒说明书步骤进行操作，取已离心上清50 μL加入已包被有HBsAg或HBeAg抗体的96孔板中，每孔再加入50 μL酶标结合物，封板，振震荡混匀，于37℃温箱中孵育30 min，手工洗板5次，加入发光液A和B，封板，避光，振荡混匀，酶标仪检测发光值。

1.8 做图及统计学分析

用软件Graph Pad Prism 5做图，进行统计分析，数据以x±s表示，假设检验采用t检验或方差分析，P值以星号表示（***为P＜0.001，**为P＜0.01，*为P＜0.05）。

2 结果

2.1 靶向c-Raf-1的反义核酸抗HBV筛选

以0.4 μmol/L剂量转染反义核酸至HepG2.2.15细胞，ELISA检测细胞上清中的HBsAg和HBeAg表达水平，结果见图1，反义核酸Raf-3145对HBsAg具有较好的抑制作用。

2.2 反义核酸Raf-3145抗HBV的剂量依赖关系

分别将反义核酸Raf-3145以0.2、0.4、0.8和1.6 μmol/L的剂量转染HepG2.2.15细胞，正义序列与反义序列剂量为1.6 μmol/L，考察Raf-3145抑制HBV的剂量依赖关系，ELISA方法检细胞上清中HBsAg和HBeAg水平，结果显示Raf-3145对HBsAg的表达具有一定的抑制作用，并和剂量呈正相关（图2）。

图1 反义核酸对HepG2.2.15细胞上清HBsAg、HBeAg表达的抑制作用

2.3 反义核酸Raf-3145对HepG2.2.15细胞的毒性检测

分别将反义核酸 Raf-3145 以 0.4、0.8、1.6、3.2 μmol/L的剂量转染HepG2.2.15细胞，8 h后换液正常培养，并于转染96 h后加入CCK-8，于37℃、5%CO2孵育箱中孵育0.5～1 h，于酶标仪上检测D450nm值，结果显示当给药浓度在3.2 μmol/L时细胞稍显毒性（图3）。

2.4 RT-PCR检测反义核酸Raf-3145对c-Raf-1基因mRNA水平的抑制作用

分别将反义核酸Raf-3145以0.4、0.8和1.6 μmol/L的剂量转染HepG2.2.15细胞，正义序列与反义序列浓度为1.6 μmol/L，8 h后换液正常培养，并于转染96 h后提取细胞总RNA，浓度结果显示细胞总RNA纯度较好（D260nm/D280nm为1.8～2.0），琼脂糖凝胶电泳结果显示无降解。取等量的总RNA 1 μg，按要求进行RT-PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳结果显示，Raf-3145对HepG2.2.15细胞中靶基因c-Raf-1的抑制效果比较明显，并呈现一定的剂量依赖关系（图4）。

图2 Raf-3145对HepG2.2.15细胞上清HBsAg和HBeAg表达抑制的剂量依赖关系

图3 CCK-8检测反义核酸对HepG2.2.15细胞的毒性作用

图4 Raf-3145对HepG2.2.15细胞内c-Raf-1基因mRNA水平的抑制作用

2.5 反义核酸Raf-3145抗HBV体内药效学评价

利用HBV小鼠水动力模型评价了反义核酸Raf-3145的体内抗HBV活性，ELISA定量检测结果表明只有Raf-3145高剂量组对HBsAg呈现出较明显的抑制作用，其他组对HBsAg和HBeAg的抑制作用不明显，个别时间点还呈现了一定的促进作用（图5）。与对照组比较，各给药组均无明显的体重下降趋势；解剖结果肉眼未见明显器质性病变，表明在该剂量范围内未见明显毒性（图6）。

图5 反义核酸Raf-3145对小鼠血清中HBsAg、HbeAg表达的抑制作用

图6 反义核酸Raf-3145对小鼠体重的影响

3 讨论

Raf激酶有3种不同亚型，即Raf-1/c-Raf-1、Raf-A和Raf-B。Raf-A和Raf-B表现出独特的组织表达形式，但c-Raf-1的表达更广泛[12]。目前，对于HBV是如何调节c-Raf-1表达的机制还不是很清楚，但有研究显示，HBV能通过增强Raf-1启动子的活性，提高其在HepG2.2.15细胞中的表达[13]。以往研究c-Raf-1在肝细胞肝癌组织中的表达多数与Raf1/MAPK信号通路的激活有密切关系，且c-Raf-1在此过程中起重要作用[14]。HBV转录激活的2种蛋白均可引发该通路的激活，HBV的X蛋白更是与肝癌的发生、发展有着密切关系[15]。另外，c-Raf-1还与其他多种癌症的发生、发展相关[3，16-19]。c-Raf-1作为癌症治疗的靶点已有相关报道，Kasid等证明用特异反义核酸ISIS-5132干扰c-Raf-1基因后，能够抑制无胸腺小鼠体内的人类肺、卵巢及乳腺肿瘤异种移植物的生长[20]，并首次证明了c-Raf-1基因是抗癌症研究中有效的靶点；还有研究显示用脂质体介导转染的靶向c-Raf-1的反义核酸可明显抑制卵巢癌细胞c-Raf-1蛋白的表达[21]。

当前治疗乙肝的药物主要靶向病毒自身，容易产生耐药性，靶向HBV复制必需的宿主基因有望解决这一问题。c-Raf-1在HBV复制过程中的机制虽不是很清楚，但其在HBV复制中的关键角色却是确定的。本研究的新颖之处在于首次利用反义技术设计靶向宿主基因c-Raf-1的反义核酸，探讨c-Raf-1作为抗HBV靶点的有效性。为了便于体内外同步筛选验证，我们选择的靶序列为人鼠同源序列，同时尽量避免脱靶效应。体内外结果显示Raf-3145对HBsAg的表达表现出较好的抑制作用。考虑到c-Raf-1基因参与了HBV的复制过程，且有研究显示c-Raf-1在肝癌患者体内的表达与HBV有关[13]，因此靶向c-Raf-1的药物不但可抑制HBsAg的表达，有利于打破免疫耐受，而且可能延缓HBV导致的肝癌发展进程，具有重要的研究和开发价值。

综上所述，本研究筛选并证实靶向基因c-Raf-1的反义序列Raf-3145具有一定的抑制HBsAg表达的活性，进而验证了靶基因c-Raf-1的可靠性。考虑到反义序列Raf-3145具有的潜在开发价值，值得对其进行进一步的药效学和毒性研究。

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