微小RNA分析技术研究进展

刘潜 ，付洁 ，宋海峰

1.中南大学 药学院，湖南 长沙 410010；2.军事医学科学院 放射与辐射医学研究所，北京 100850

微小RNA（microRNA，miRNA）是一类起重要调控作用的非编码小分子RNA。研究表明，miRNA-靶基因、miRNA-miRNA之间形成调控网络，处于关键调节枢纽的miRNA有望成为疾病治疗的靶标[1]或作为未来诊断疾病的有效生物标志物[2-3]。成熟miRNA具有以下特点：片段小，一般为18～25 nt；种类多，最新miRbase 18.0数据库已收录18 226条前体 miRNA与 21 643条成熟miRNA（http://www.mir⁃base.org）[4-5]；差异小，miRNA家族成员之间通常只相差一个碱基；表达水平低，相对于mRNA的表达量来说，miRNA的表达水平低。

针对miRNA基础研究与后续药物研发的4个主要不同阶段（确定候选miRNA，miRNA时间/空间的表达差异，miRNA机理研究，miRNA候选药物研究），我们着重阐述不同阶段所普遍采用的先进分析技术：候选miRNA研究的克隆测序类技术；miRNA表达谱高通量芯片技术；目的miRNA及其前体表达水平的实时荧光定量PCR（qPCR）和Northern印迹技术；miRNA类核酸药物的药代动力学评价技术。

1 候选miRNA克隆测序类技术

克隆测序最早用于miRNA的分析和监测，尤其是对于未知序列miRNA的确定，为发现新的候选miRNA提供基础。最初的克隆测序方法首先需要对miRNA进行cDNA的文库构建，再进行PCR扩增，扩增产物随后克隆到表达载体中，最后进行测序，该方法需要较大的初始样本（几百微克RNA）[8]。随后Takada建立了一种快速扩增克隆法[9]，可以在较少样本量的时候极大地提高miRNA检测的灵敏度和准确度，但通量不够（5种miRNA/反应）。Cummins在该方法的基础上研制出标签序列克隆法[10]，将通量大大提高（35种miRNA/反应），并被首次成功地应用于描绘成年小鼠睾丸和卵巢miRNA表达水平谱。

随着RNA组学研究的开展，上述方法面对组织中海量的miRNA仍显低效，新一代大规模平行测序平台应运而生，如Roche Applied Science公司的454基因组测序技术、Illumina公司和Solexa technol⁃ogy公司合作开发的Illumina测序技术、Applied Bio⁃systems公司的 SOLiD（supported oligonucleotide li⁃gation and detection）测序技术等[11-12]。新型高通量测序技术均基于一种新的测序策略，即循环芯片测序法（cyclic-array sequencing），即对布满样品的芯片重复进行基于聚合酶反应（模板变性、引物退火杂交及延伸）及荧光序列读取反应。该策略通过检测目标miRNA的标签序列和出现频率，达到寻找和发现新miRNA的目的，能同时测定几百种miRNA。Il⁃lumina基因组分析仪测定读长为50 nt，采取每次反应封闭3'端，使反应中只能加入1个核苷酸，同时每次延伸都将上一步反应试剂清洗，因此具有所需样品少、数据误差小、操作流程简单等特点。SOLiD系统的测定读长为35 nt，在测序过程中每个碱基在2个连接反应过程中分别被测定，即每个碱基会被检测2次，准确度高，单次运行所得数据量大，适于miRNA的研究。Roche 454基因组测序仪测序读长可达400～500碱基，而miRNA序列长度仅为22碱基，所以该测序仪常用于新物种的基因组测序和转录组测序，极少用于miRNA测序[13]。Schotte等运用Solexa深度测序技术对70个病例中的7种儿科急性成淋巴性白血病的miRNA谱进行绘制，发现了28种新的miRNA及431种候选新miRNA，为儿科急性成淋巴性白血病中miRNA功能研究奠定了基础[14]。Liu等用454基因组测序技术和SOLiD深度测序技术研究进化过程中miRNA参与新生组织的功能[12]。目前主要用克隆测序方法中的Illumina和SOLiD技术来重点解决对未知序列miRNA的初步了解及其初步表达情况的问题，为挖掘新miRNA奠定基础。

2 miRNA表达谱的高通量分析技术

研究者须进一步研究目的miRNA（已知序列）的时相性和空间性及表达水平差异，因此miRNA芯片技术得以开发和应用。miRNA芯片技术主要包括固相微阵列芯片和液相芯片技术。固相微阵列芯片的主要原理为：在玻璃片或尼龙膜等固体支持物上固定高密度已知序列的DNA捕获探针，利用杂交原理使多种标记了的miRNA目标分子与捕获探针杂交，通过检测杂交信号强度及数据处理，获得不同标本中特异miRNA的表达谱，从而全面比较不同物种的不同器官或组织及正常和患病组织中miRNA表达水平的差异。根据所用的不同的标记试剂，可分为同位素标记检测[15]、荧光标记检测[16]、化学发光标记检测[17]和纳米粒子标记检测[18]。固相微阵列技术的优势在于能够迅速和高通量地确定miRNA表达谱，但其问题在于不同检测探针与待测物之间会发生交叉反应，因此实验的准确度和精密度较差，且制作和检测费用高。

Luminex-xMAP液态芯片技术则是一种基于微球杂交的流式细胞检测方法（bead-based hybridiza⁃tion technology），它可以对同一个微量样本中的多个不同miRNA分子快速定量。其基本原理：首先采取逐步降温杂交法，使目标序列miRNA与生物素标记的互补探针杂交，随后使特定编码的磁性微球与复合探针杂交，每一个特定编码微球对应相应的探针，在此过程中，未形成双链的游离探针、非特异结合到探针上的miRNA和其他单链RNA会被相应的单链酶降解；最后加入链亲和素-藻红素荧光报告分子，与复合探针上的生物素结合，在报告激光的作用下产生报告荧光，报告荧光物质和微球内的编码荧光物质分别受到定量激光激发和定性激光激发，激发后光信号转化为电信号，通过计算机的分析处理，确定微球结合的分析物的定性和定量信息。与微阵列芯片相比，Luminex-xMAP液态芯片技术中的微球处于液相悬浮状态，其微球表面固定的探针类似于液相探针，更有利于捕获待测靶miRNA序列，且运用单链核酸酶能最大程度地避免固态芯片中的交叉反应，克服了微阵列芯片的不足。Lu[19-20]等较早应用该方法确定了人类肿瘤样本（肝癌、直肠癌、胰腺癌及胃癌）的miRNA表达谱。由于Luminex既具有高通量、快速、微量检测的优点，又具有在同一个试验样品中同时检测不同目标物的优点，已被广泛用于研究同一个细胞内不同miRNA的相对表达。

3 目标miRNA和前体表达的定量技术

获得目标miRNA（hit-miRNA）后，须对其机制进行深入研究。反转录-实时定量PCR（RT-qPCR）和Northern印迹可以对成熟和前体miRNA进行定量。目前RT-qPCR策略主要有以下3种：引物延伸法[21]、polyA加尾法和茎环PCR法。由于该类方法通常需要基于U6等内参基因校正，且无须明确miRNA的绝对量，属于相对定量范畴。

引物延伸法和polyA加尾法均基于特殊的酶连反应，使反转录产物在序列长度上增长且包含特定序列，利用针对特定序列的引物进行后续qPCR扩增。但这2种方法中T4DNA连接酶的连接效率和连接作用可能改变其原本的序列，成为影响灵敏度和特异性的关键[7]。

茎环PCR法不需要酶连反应，仅通过对miRNA序列特异互补的茎环反转录引物和通用TaqMan探针即可定量，且具有良好的特异性和灵敏度。虽然TaqMan探针需要专门设计和合成，成本较高，不适合一次检测多个miRNA，但该方法逐渐成为miRNA相对定量的金标准，为研究miRNA的调节网络和机制阐述提供了有利工具。为进一步增强qPCR方法的定量能力，Li等设计了一种更加巧妙的茎环探针来代替通用的茎环探针，由于采用了2个互补的茎环探针，相对于仅采用3'端茎环的探针法，该方法进一步提高了特异性，已用于检测4种miRNA在小鼠10种组织中的相对表达量，为癌症的临床诊断和研究提供了有利的工具。

qPCR不仅可对成熟miRNA进行定量，也可用于前体miRNA表达谱的分析。Chugh等建立了一种基于SYBR的qPCR方法，对miRNA前体和成熟体进行检测，即主要采用全自动机器操作PCR整个流程和选取具有相同退火温度的186对引物，以便在同一块板上用相同的优化条件进行定量，从而探究miRNA的产生机制。Baker等[25]运用分子信标方法，在短时间（20～30 min）内通过相对定量可确定细胞和组织液中成熟miRNA及其前体表达水平。其主要原理：分子信标与靶标RNA发生特异性结合时，其茎环结构打开（从而淬灭基团与荧光基团分离），在激发光作用下产生荧光信号。Baker等运用该方法对miR-21及其前体的相对表达量进行了检测，以探究同种miRNA与其前体之间的关系。

Northern印迹是检测miRNA的经典方法[26]，适用于大多数实验室。该方法可有效检测成熟与前体miRNA表达水平，但灵敏度低、定量范围窄、总RNA样品需求量大及放射性32P的使用等限制了其应用范围。为此，研究者进行了一系列改良：如采用锁核酸探针替代传统探针以提高灵敏度[27-28]；用地高辛（DIG）标记替代放射性磷标记，在保证灵敏度的前提下增加实验的安全性；用EDC（1-乙基-3-二甲基丙胺-碳化二亚胺）促进RNA分子转膜[29]。Kim[30]综合利用各种措施，使得Northern印迹检测miRNA的定量下限为0.05 fmol/L，大幅提高了定量范围和灵敏度。改良Northern印迹检测法不仅有利于miRNA及其前体的相关研究，也有利于对实验室操作成本和环境的控制。

对目标miRNA表达的定量方法还有其他多种，例如引物入侵法[31]、纳米金标法[32]、纳米金银染倍增法[33]、单分子检测法[34]、直接与间接电化学法[35-36]、光电共振法[37-38]。上述方法尽管各有特点，但整体而言，由于缺乏微阵列芯片和Luminex等技术的高通量特性、qPCR技术的高灵敏度与成熟性及Northern印迹的广泛适用性，其应用尚有较大限制，需要进一步的探索和改进。

4 miRNA药物的药代动力学评价技术

目前miRNA作为治疗剂已进入应用阶段，已有研究表明通过拮抗miRNA对从病毒感染到癌症均有良好的药理治疗作用，相对大多数作用于mRNA的反义药物来说，作用于miRNA的药物能更加精确，且能作用于有相同种子序列的基因家族[39]。研究表明，多种拮抗miRNA的antimiR药物在动物模型体内显示出良好的药理作用[40]。Miravirsen（MIR）是第一个获准进入临床试验的该类药物，现处于临床Ⅱ期试验阶段。MIR是miRNA-122的拮抗模拟类似物，用于治疗丙肝病毒（HCV）感染[41-42]。随着miRNA类核酸药物时代的开启，旨在阐明miRNA药物作为治疗剂的体内过程及作用机制的药代动力学评价技术显得格外重要。miRNA药物的药代动力学评价分析技术不同于前述定量技术，通常要求对生物基质中的miRNA药物直接定量检测，属于绝对定量分析，能更真实地反映体内的过程。

目前miRNA药物的药代动力学评价主要为杂交酶联免疫法。Kenneth等通过杂交酶联免疫对血浆和细胞裂解液中甲基磷酸化修饰的miRNA进行定量分析[43]。该方法是利用序列特异性捕获探针与目标miRNA杂交，并与地高辛标记的检测探针形成复合体，通过显色系统进行定量。目前该方法对甲基磷酸化修饰的miRNA的定量范围为10 pmol/L～1 μmol/L。Wang[44]等利用这种超灵敏的方法，评价了2′-MeOPSmiR16-1、2′-MeOPSmiR29和2′-MeOP⁃SantagomiR155等3种修饰后miRNA的盒式给药（cassette dosing）（又称组合给药）情况下，在血浆、外周血细胞及骨髓组织中的药代动力学和药效学，发现联合多种miRNA给药的方式能延长各自末端半衰期，且能够提高药效，为miRNA的类似物或拮抗剂作为临床治疗药物的研究提供了实验基础。此外，MIR的药代动力学研究也采用该方法完成[45]。

5 结语

根据miRNA各自特点和应用情况，目前miRNA分析方法可简要概括如表1。准确、科学的定性和定量分析方法是阐明miRNA调节机制的物质基础，也是以miRNA作为生物标志物进行诊断的前提，更是以其作为核酸类药物评价不可或缺的部分。基于不同研究目的的miRNA检测分析方法的建立与合理应用具有重要意义。因此，对传统分析方法进行改良，开发全新分析技术，以达到高灵敏、高通量、样品需求量小、低成本的要求，是未来miRNA分析技术发展的方向。

表1 miRNA定量方法的特点和应用

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