RP-HPLC、UV及容量法测定甲硝唑的含量

张 娜，徐 强，周 娟

（1黄山学院 化学化工学院，安徽 黄山 245041；2黄山食品药品检验研究所，安徽 黄山 245041）

甲硝唑，化学式为C6H9N3O3，是咪唑类抗阿米巴、抗滴虫、抗厌氧菌药，因其具有抗菌力广、杀菌力强、毒副作用小、无耐药性等优点，现已成为治疗厌氧菌感染的基本药物之一［1］.其传统的剂型主要有片剂和注射剂，临床应用主要用于治疗牙周疾病、抗腹部术后感染、抗阴道滴虫等.

甲硝唑含量测定的方法有很多，如紫外分光光度法［2］，反相高效液相色谱法［3-4］，差分脉冲溶出伏安法［5］，气相色谱-质谱联用法［6］，流动注射化学发光法［7］、反相流动注射化学发光法［8］，荷移增敏分光光度法［9］等.除以上几种方法外，姜爽等人曾采用pH滴定法［10］进行测定，但该方法有严格的浓度上的限制，不宜采用；朱梅芳采用的是双波长分光光度法［11］，此方法利用多种波长测定，操作较为繁琐，不便于快速测定.

《中国药典》2000年版中对甲硝唑的含量测定使用容量法［12］.反相高效液相色谱法（RP-HPLC）分离效率高，灵敏度高，速度快，且配以数据处理系统，大大提高了其结果的准确性，能够将甲硝唑中的其它成分有效分离，并测出单一组分甲硝唑的含量［13］.而紫外-可见分光光度法（UV）测定甲硝唑的操作条件要求不高，并且具有简便、快速及准确的优点，因此也被广泛地应用［14］.为分析三种方法的优缺点，本文拟通过实验建立RP-HPLC、UV及容量法三种方法测定甲硝唑含量的方法对比.

1 实验材料与方法

1.1 实验仪器及药品

甲醇为市售色谱纯，盐酸、冰乙酸、醋酐、高氯酸、α-萘酚苯甲醇均为市售分析纯，实验用水为超纯水；甲硝唑片剂为湖北华中药业有限公司生产；甲硝唑对照品为分析纯，中国药品生物制品检定所生产.

Sartorius BS110S电子分析天平（北京赛多利斯天平有限公司）；UV-2550紫外分光光度计（SHIMADZU公司）；Agilent 1200高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）

1.2 实验方法

1.2.1 容量法

参照2005版药典二部的相关内容.取甲硝唑20片，精密称定，细磨.根据药典上关于甲硝唑约0.13 g的量的规定，精密称取适量细粉，然后缓慢加入冰乙酸10 mL，搅拌使之完全溶解.再滴加1%的萘酚苯甲醇指示液约2滴，用高氯酸滴定液（0.1 mol/L）滴定，直至溶液呈浅绿色为止.实验结果的校正可利用空白试验.用1 mL高氯酸滴定液相当于消耗17.12 mg C6H9N3O3的量的比例来计算药片所含有甲硝唑的量.

1.2.2 紫外分光光度法

参照2005版药典二部的相关内容.取本品10片，精密称定，细磨.根据药典上关于甲硝唑约50 mg的量的规定，精密称取适量细粉.然后用漏斗将药粉导入100 mL量瓶中，再加入HCl溶液（0.1 mol/L）80 mL，水浴微温使之完全溶解.待其温度恢复到室温后，用HCl溶液（0.1 mol/L）稀释至刻度.摇匀后滤过，滤液精密量取5 mL，置于200 mL量瓶中.再用HCl溶液（0.1 mol/L）稀释量取的滤液至刻度，摇匀后测定其在277 nm的波长处的吸光度值.结果根据药典上关于甲硝唑药片吸收系数的规定，按照吸收系数为377计算即可.

UV-2550的测量方式为吸收值；狭缝宽为0.2 nm；光源转换波长为350.0 nm；室温为17℃；相对湿度为60%.波长范围（nm）为290.0到260.0；扫描速度为中速；采用间隔为0.2 s；自动采样间隔为停用；扫描模式为自动.

空白溶剂的适用条件按照标准规定，波长在251 nm到300 nm处的吸光度值不得超过0.10.本实验测得空白溶剂在277 nm波长处的吸光度值为0.049，符合标准.

1.3 高效液相色谱法

溶液制备参照2005版药典二部的相关内容，对照品需要在105℃下干燥至少2 h以上才能使用.用分析天平称取0.124 5 g甲硝唑对照品，置于50 mL容量瓶中，加适量50%甲醇（约30 mL）振摇使其溶解，当其完全溶解后用流动相定容至刻度，制成的溶液中含2.49 mg/mL的甲硝唑.供试品溶液是根据药典上关于甲硝唑约100 mg的量的规定，精密称取适量细粉，然后用漏斗轻轻导入到50 mL容量瓶中，加适量50%甲醇（约30 mL）振摇使其溶解后用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm的滤膜滤过.

分别量取对照品溶液和供试品溶液各20 μL注入高效液相色谱仪中，并且记录色谱图和相关数据.本实验方法采用的是外标法，故以峰面积计算.

高效液相色谱仪器参数与适用性条件如下：色谱柱：Gemini C18 125×4.6 mm，5 μm，填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶，流动相：甲醇-水（20∶80），流速：1.0 mL/min，柱温：30 ℃，检测波长：320 nm，进样量：20 μL.

2 结果与讨论

2.1 实验结果

容量法：两次样品取样量分别为0.171 9 g，0.172 1 g，消耗体积分别为7.45 mL，7.33 mL，空白消耗体积为0.05 mL.用1 mL高氯酸滴定液相当于消耗17.12 mg C6H9N3O3的量的比例来计算药片所含有甲硝唑的量，可得标示含量分别为93.19%，91.57%，平均值为92.38%，相对偏差为1.75%.其中标示含量按照下式计算，即：

式中，V样品=V总-V空白，即扣除空白后样品实际消耗的滴定液体积.

UV法：两次取样量分别为0.066 28 g，0.065 78 g，测得样品在277 nm波长处的吸收值分别为0.513、0.512.空白溶剂在277 nm波长处的吸光度值为0.049.计算可得标示含量分别为98.20%，98.74%，平均值为98.47%，相对偏差0.55%.其中标示含量按照下式计算.

式中，A样品=A总-A空白，即扣除空白后样品的实际吸光度值；E为吸光度系数，甲硝唑的吸收系数为377.

RP-HPLC 法：对照品峰面积（n=5）分别为 7 579.6，7 601.7，7 590.6，7 589.3，7 583.8，平均峰面积 7 592.2，RSD值（应不大于2.0%）为0.09%，响应因子（f）为3 049.1.两次取样品分别为0.165 2 g，0.165 2 g，供试品峰面积（n=2）分别为：7 411.4，7 413.2.计算可得标示含量分别为97.26%，97.28%，平均值为97.27%，相对偏差0.02%.其中标示含量按下式计算.

式中，A为峰面积，f为响应因子.

三种实验方法的结果比较见表1.

表1 RP-HPLC、UV及容量法测定甲硝唑的含量对照

2.2 结果分析与讨论

参照《中华人民共和国药典》二部2005版有关标准的规定，所测甲硝唑的含量，应为标示量的93.0%到107.0%.从表1可以看出，本实验中容量法、UV法、HPLC法所测定的甲硝唑的平均标示含量分别为92.38%、98.47%、97.27%.相对偏差分别为1.75%、0.55%、0.02%.其中，容量法所测定结果已超出标示量范围，且相对偏差明显偏大.在容量法中，使用萘酚苯甲醇作为指示剂，该指示剂在碱性范围为蓝绿色，酸性范围为黄至绿色，以溶液呈浅绿色为滴定终点，由于酸碱型体的颜色对比度不高，在实际操作过程中，对于滴定终点的判断存在一定困难，容易造成较大误差.但该法样品处理过程无需过滤即可直接滴定，因此方便用作实验室的常规分析，但不适合作为质量控制的手段.

UV法和HPLC法测定甲硝唑片剂中甲硝唑的含量，均在药典标示量范围内，且相对偏差较小，准确度高，精密度好.其中，UV法需要扣除试剂空白，而HPLC法由于具有分离系统色谱柱的存在，无需扣除试剂空白，专属性更强，选择性更高，干扰更小.综合考虑仪器的普及率以及实验的成本，UV法适合成分较简单的原料药的分析，而HPLC法更适合复杂样品的分析.

3 结语

甲硝唑有多种分析方法，各有优点与不足.章竹君采用的流动注射化学发光法［7］、李宇等人采用的反相流动注射化学发光法［8］、李芳等人的荷移增敏分光光度法［9］、姜爽采用的pH滴定法［10］以及朱梅芳采用的双波长分光光度法［11］等方法测定甲硝唑片中甲硝唑的含量都实际可行.但较之高效液相色谱法和紫外分光光度法，均不够简便、快速和准确，操作也较为繁琐.本实验结果表明：采用高效液相色谱法和紫外分光光度法测定甲硝唑的含量均方便、快速并且准确.但较之紫外分光光度法而言，高效液相色谱法的专属性更强，灵敏度更高，结果也更可靠和准确，适合成分复杂制剂的质量控制，所以高效液相色谱法更适用于甲硝唑药品含量测定的精密检测.故建议采用HPLC法测定甲硝唑片的含量.

为了更好的提高检验质量，还应该进一步研究探索，特别是在提取、分离方法上，以期发现更加合理的检测方法.

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