R-2-氯丙酸脱卤酶的定向进化

秦迎春，刘 鹏，杨立荣，徐 刚，吴坚平

(浙江大学 化学工程与生物工程学系，杭州 310027)

光学纯的S－2－氯丙酸(S－2－CPA)在芳氧丙酸类除草剂合成中具有重要用途。该类除草剂中都有1个手性碳原子，具有2种光学异构体。其中由S－2－CPA合成的D－(－)异构体为高效体，药效比L－(+)异构体高6～12倍［1］。鉴于S－2－CPA重要的工业应用价值，开发高效低成本酶法制备高光学纯度S－2－CPA的方法就很有意义。R－2－CPA脱卤酶可以选择性脱除R－2－CPA中的Cl，当将其用于消旋2－CPA的动力学拆分时，在反应体系中剩余未反应的底物即为S－2－CPA。目前，R－2－CPA脱卤酶的品种少，活性稳定性等性质也不尽如人意，因此仍需要寻找新的R－2－CPA脱卤酶，或者改造原有的R－2－CPA脱卤酶，以适应工业需要。

笔者所在实验室在农药厂附近的含氯污泥中分离到了1株有R－2－CPA脱卤酶活性的菌株［2］，林春娇等［3］从该菌株中克隆了 R －2 － CPA脱卤酶DehDIV－R的基因。目前，DehDIV－R野生型基因通过载体pET30a(+)在大肠杆菌BL21构建的工程菌，经诱导条件优化，发现酶的比酶活可达10.43 U/mg，催化能力较强，有很好的工业应用潜力。但是仍有希望通过酶的分子改造获得酶活更高、热稳定性更强的突变体，以适应工业应用要求。

笔者采用定向进化［4－7］的手段建立高通量筛选突变文库，再经过高通量筛选得到酶活提高的突变子，以期研究突变子中突变位点的改变前后对酶催化活力影响的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒

大肠杆菌BL21(DE3)，DehDIV－R菌株由笔者所在实验室保藏，电转化感受态细胞BL21(DE3)［8］由笔者所在实验室自行制备。表达质粒pET30a(+)购于美国Novagen(WI)公司。

1.1.2 工具酶与试剂

限制性内切酶Eco RI和Hind III以及T4 DNA连接酶、Pfu DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、PCR反应所需试剂均购买于TaKaRa公司。卡那霉素购自Sigma公司，PCR引物由上海生物工程有限公司合成，DNA试剂回收盒购自上海生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 高通量筛选方案

根据文献［9］的Cl检测方法，建立了一种基于Cl+浓度的显色反应的高通量筛选方法，用于快速、有效地检测水解R－2－氯丙酸的速率，从而能够对脱卤酶的活性进行初步筛选。对于构建好的DehII－S突变文库，采用96孔板进行表达。操作流程:将40 μL的发酵上清移至96酶标板中，逐步添加60 μL 的饱和 Hg(SCN)2乙醇溶液，150 μL 60 g/L的FeNH4(SO4)2·12H2O(含1%硝酸)水溶液和50 μL试样，室温下放置10 min后，在酶标仪中检测450 nm下的吸光值OD450。

1.2.2 蛋白纯化

先将破胞获得的上清粗酶液用0.22 μm的滤膜过滤，准备上样。使用上样缓冲液A(binding buffer)冲以流速1.0 ml/min平衡 Ni2+亲和层析柱。将过滤后的粗酶液上样，用缓冲液A洗10个柱体积，再用洗脱缓冲液B(20 mmol/L Na3PO4缓冲液(pH 7.4)，500 mmol/L NaCl，250 mmol/L 咪唑)洗脱，收集酶液。使用AKTA蛋白质纯化系统用脱盐柱(HiTrap Desalting，GE Healthcare)对纯化后的酶液进行脱盐。为了有较好的脱盐收率和效果，对每次上样量进行调整，确定每次上样量为1.5 mL。脱盐液用 SDS － PAGE［10］分析纯度，并用于后续测定。

1.2.3 蛋白含量测定

蛋白含量采用 Bradford［11］法测定。

1.2.4 酶比活力测定

酶活定义为每分钟催化降解1 μmol 2－氯丙酸生成1 μmol Cl－所需的酶量为1 U。以(S)－2－CPA作为反应底物，采用Gly－NaOH缓冲液(pH 9.5)作为缓冲体系。反应体系为1 mL，底物终浓度是30 mmol/L，在37 ℃下反应0、3、6和10 min。添加1%硝酸终止反应，离心去除酶。酶活通过有机酸柱液相色谱检测底物消耗量方法来计算。

采用高效液相色谱Agilent 1100系统和有机酸柱Bio－Rad HPX－87H(30 cm×7.8 mm)对R－2－氯丙酸和脱卤产物乳酸以及底物谱中的2－氯丙酸、乳酸进行分析测定。测定条件:室温下，流动相为5 mmol/L H2SO4，流速为0.6 mL/min，紫外检测波长为210 nm，进样量为5 μL。2－氯丙酸和乳酸的保留时间分别为20.86和12.289 min，外标法得到的标准曲线分别为:

Y=40.08x，R2=0.9991(x为2－氯丙酸浓度(mmol/L)，斜率为40.08);

Y=29.71x，R2=0.9997(x为乳酸浓度(mmol/L)，斜率为29.71);

纯酶的比酶活按式(1)计算:

式中:比酶活EA1的单位为U/mg，ΔA为反应时间内紫外吸收峰面积的变化值，V1为反应体系的体积(1 mL)，k为标准曲线的斜率，p为酶质量浓度(mg/mL)，t为反应时间(min)，V2为酶的体积(mL)。

发酵液体积酶活按式(2)计算

式中:比酶活EA2的单位为U/mL，ΔA为反应时间内紫外吸收峰面积的变化值，V1反应体系的体积(1 mL)，k为标准曲线的斜率，t为反应时间(min)。

2 结果与讨论

2.1 突变文库的构建与高通量筛选

以DehDIV－R为模板，在Mg2+浓度为7 mmol/L、Mn2+浓度为0.4 mmol/L的条件下进行易错PCR建库，随机挑取10～20个菌落送去上海生工测序，测得突变率为0.15%。发现满足易错PCR建库要求，保证大部分的突变含1～2个突变位点。通过电转化得到2000多个突变子，构成易错PCR突变文库。经过4次筛选得到的突变子库如表1所示。

表1 dehDIV-R的突变子库Table 1 Mutant library of dehDIV-R

2.2 突变子的纯化

控制接种量与诱导条件，尽量使突变子表达情况同步，结果如图1所示。由于DehDIV－R的表达载体仍为pET30，所以重组蛋白带有组氨酸标记，采用纯化策略，纯化各个突变子，纯化情况如图2所示。

图1 DehDIV-R不同突变子的SDS-PAGE凝胶电泳Fig.1 SDS-PAGE gel electrophoresis of different DehDIV-R mutants

2.3 同源建模与分子对接

图2 DehDIV-R突变子E7的蛋白纯化Fig.2 Protein purification gel of DehDIV-R mutant E7

为了进一步研究所得突变体的结构与功能变化，并且验证和发展之前对Asn203位点与手性选择性关系的推测，首先使用 Sybyl中的 advanced protein modeling(APM)模块对DehDIV－R进行同源建模分析。选取与DehDIV－R相似性最高(序列相似性23.71%)的来自 Pseudomonas putida PP3的 DehI(PDB:3BJX)酶作为模板，模拟得DehDIV－R的三级结构如图3所示。由图3可知:其Z－score为21.57，可信度为可信(certain)。来自P.putida PP3的DehI(PDB:3BJX)的预测催化机制是酸性氨基酸活化水分子，从Cl－的相反方向进攻底物分子的α－碳原子，从而催化脱卤。出发酶DehDIV-R、突变体DehDIVG2、DehDIV－E7与R－2－氯丙酸的对接结果分别见图4。由图4可知:对接打分与活化能的对应关系，计算得到DehDIV－G2的活化能比DehDIV－R相应的下降0.964 kJ/mol，从而使得DehDIV－G2的比酶活提高了25.2%;DehDIV－E7的活化能比DehDIV－R相应的下降2.5498 kJ/mol，从而使得DehDIV－E7比酶活提高了38.7%。

图3 DehDIV-R的三维结构活性位点与底物结合口袋部分用原子堆积模型标出Fig.3 Three-dimensional structure of DehDIV-R active sites combined with substrate pocket part marked by atomic accumulation model

图4 脱卤酶与R-2-氯丙酸的分子对接模型Fig.4 Molecular docking model of dehalogenation enzyme and R-2-CPA

2.4 双点突变子的酶比活力预测

根据对突变子库中酶比活力提高的突变位点进行的综合分析，发现单点突变未能获得酶比活力大幅提高的进化酶。因此，进一步考察突变双位点对酶比活力的影响。根据突变子DehDIV－E7和DehDIVG2与R－2－氯丙酸的对接结果可知，虽然突变位点都与催化残基位点距离较远，但是对酶催化R－2－CPA有促进作用，使得酶与底物的结合能降低。因此，预测2个突变位点的综合作用，应该可以更大幅度的降低结合能，提高酶催化活力。通过SYBYL模建了4种进化酶，分别为 Asp272Ser，Asp235Ser;Asp272Val，Asp235Ser;Asp272Ser，Asp235Val 和 Asp272Val，Asp235Val，分别命名为 DehDIV － SS，DehDIV － VS，DehDIV－SV和 DehDIV－VV。在同样的入口值(Threshold)和膨胀值(Bloat)下，选择最佳的反应口袋，并以此与R－2－氯丙酸对接，选择最佳的对接构象，打分结果如表2所示。上述4个进化酶与R－2－CPA的分子对接(图4)。由图4可和表2可知:活化能比原始酶降低了6.2282、5.7266、5.6848和5.0578 kJ/mol。因此，预测上述4个进化酶的酶比活力也会获得大幅提高。

易错PCR是在采用DNA聚合酶进行目的基因扩增时，通过调整反应条件来改变扩增过程中的突变频率，从而以一定的频率向目的基因中随机引入突变，获得随机突变体［12］。此方法在许多酶的改造上取得了不少的成果［13－14］。而它最关键在于对何时突变频率的选择，突变频率太低则会导致文库中野生型群体过多;突变频率太高则导致绝大多数突变为有害突变，无法筛到有益突变。

表2 不同突变子的分子对接打分Table 2 Molecular docking marking of different mutants

3 结论

通过调节易错PCR体系中Mn2+浓度，调整突变率，使氨基酸突变维持在1～3个的最佳范围内。基于溶液 Cl－增加，并通过与 Hg(SCN)2和Fe(NH4)SO4反应会发生颜色变化的高通量筛选方法，快速、有效地用于对水解R－2－CPA具有明显活力提高的酶突变体的初筛。使用此方法筛选得到有酶比活变化的突变子库，并有突变子DehDIVG2和DehDIV－E7的比酶活分别提高25.2%和38.7%，突变后E7比酶活为14.47 U/mg。并通过SYBYL对酶与底物进行分子对接，对接打分显示，DehDIV－G2的活化能下降 0.9614 kJ/mol，DehDIV－E7的活化能下降2.5498 kJ/mol。由于酶和底物R－2－氯丙酸的活化能下降，亲和能力提高，从而提高酶比活力。后续研究通过实验得到上述模拟的进化酶，测定其具体活力，并结合计算机辅助模拟软件获得酶学性质更优的突变子。

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