应用PCR-DGGE分析肉鸡呼吸道中细菌多样性

山东宝来利来生物工程股份有限公司 汪孟娟 曹银生 胡艳霞 王京京 辛国芹 徐海燕

动物呼吸道疾病易造成动物生长减缓、料肉比增高、产蛋力降低、免疫力下降，更有甚者直接导致动物死亡或者继发其他疾病死亡，给养殖户带来巨大的损失。然而使用抗生素治疗该病又会带来一系列副作用，因此开发一种通过恢复和调整动物呼吸道内菌群平衡，达到预防和治疗动物呼吸道感染的微生态制剂十分必要。Sullivan等（2001）认为，正常的微生物菌群可以起到防止潜在的致病微生物建群及防止己经存在的机会菌过度生长的作用。由此看来，研究呼吸道正常菌群的演替次序和变化特征，是深入认识炎症本质、开发呼吸道益生菌的理论依据。

1993年Muzyer等首次将变性梯度凝胶电泳（DGGE）技术应用于微生物生态学研究，并证实该技术在研究自然界微生物群落遗传多样性和种群差异方面具有明显的优越性。本试验通过PCR-DGGE技术分析了肉鸡呼吸道细菌菌群结构，并对优势菌进行了鉴定，探讨此方法在研究动物呼吸道微生物多样性的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品的采集与处理 分别取 10、20、30、40日龄的肉鸡（采自泰安某肉鸡养殖场），于超净台下分别取喉管和气管，剪碎放入无菌离心管中。

1.1.2 主要仪器 PCR仪、DGGE电泳仪（Bio-Rad）。

1.2 总DNA的提取 向装有喉管和气管的离心管中，分别加入5 mL无菌生理盐水，振荡5 min，800 r/min离心10 min，取上清于无菌1.5 mL EP管中，12000 r/min，离心 2 min，倒掉上清。DNA提取采用Mobile公司的BIO-101 DNA extraction Kit试剂盒，步骤按说明书进行。

1.3 16 S rDNA V3片段的PCR扩增 将提取的DNA直接作为PCR模板，采用对大多数细菌的16 S rRNA基因V3区具有特异性的引物对（钱丽君，2007）：341F（5’CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCA- CGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和 534R（5’-ATTAC-CGCGGCTGCTGG-3’）， 扩增长约 200 bp， 用于DGGE 分析。 PCR 反应体系 （25 μL）：2×Taq mix 12.5 μL，上下游引物（25 pmol/μL）各 1 μL，模板DNA 1 μL，无菌双蒸水 9.5 μL。PCR 反应条件：采用降落 PCR，94℃预变性 4 min；94℃ 1 min，65℃45 s，退火温度每个循环降低0.5℃，当退火温度降至55℃后，再以该温度扩增15个循环；最后72℃延伸8 min。PCR产物用1%的琼脂糖凝胶进行检测。

1.4 变性梯度凝胶电泳（DGGE） DGGE变性梯度凝胶浓度为8%，变性梯度为30%～70%（7 mol／L尿素和40%甲酰胺为100%变性）。电泳时，首先在220 V电压下预电泳10 min，随后在85 V的固定电压下电泳16 h。电泳结束后，进行硝酸银染色（Bruck等，2003），用数码相机对结果拍照，并采用 Quantity One软件 （Bio-Rad）对DGGE图谱进行聚类分析。

1.5 DGGE图谱中部分优势条带的序列分析用无菌手术刀将DGGE图谱中部分分离明显、条带清晰且亮度高的优势性条带从凝胶上切下，加入40 μL去离子无菌水，将胶块捣碎，4℃过夜。取液体做模板进行PCR扩增，引物为去掉“GC夹”的 341 F和 534 R，PCR体系和条件同上（Devillard等，2005）。扩增产物送上海生工生物工程技术有限公司测序。

2 结果与分析

2.1 16S rDNA片段的扩增 16S rDNA PCR产物琼脂糖电泳结果见图1。由图1可见，通用引物341 F及534 R对各样品细菌16 S rRNA基因均得到较好扩增。

2.2 DGGE指纹图谱及图谱分析结果 各样品DGGE指纹图谱见图2。由图2可见，不同部位比较，肉鸡的喉和气管中细菌的DGGE图谱的条带数、条带位置和亮度存在一定程度的差异，但总体来说，虽然样品条带数较多，但优势条带变化不大，条带A、B、C、D、E和F在整个养殖周期的喉和气管中一直保持优势地位，经鉴定分别为：Citrobacter sp.，Pseudomonas aeruqinosa，Pasteurellaceae bacterium，Uncultured bacterium，Gallibacterium anatis，Uncultured Enterobacteriaceae bacterium。G条带只在肉鸡养殖后期的喉中占优势，鉴定为：Mycoplasma qallisepticum。

相同部位不同日龄样品比较，养殖中、后期喉的样品条带数明显多于养殖前期，其中条带H和I在养殖中期出现后，便一直存在于整个养殖过程，并保持一定的亮度，经鉴定为Klebsiella pneumoniae和 Uncultured bacterium，条带 J虽然在养殖前期的喉管样品中已被检测到，但亮度较暗，在养殖中期的样品中开始变亮，经鉴定为Klebsiella pneumoniae；对于气管样品来说，30日龄左右肉鸡的气管样品条带数明显多于其他时期。

UPGMA相似性聚类结果表明，养殖前期样品喉中的条带与养殖中后期相似度较低，只有55%；养殖中、后期不同部位，同一时期的样品相似度均达到了75%，说明在整个养殖过程中，肉鸡呼吸道中细菌菌群结构是在发生变化的。

3 讨论

DGGE技术主要是利用梯度变性胶来分离DNA片段，理论上认为，只要选择的电泳条件，如变性剂梯度、电泳时间、电压等足够精细，有一个碱基差异的DNA片段均可被分开。DGGE具有传统微生物分析方法无可比拟的优势，在科学研究中广泛应用（Ferguson，2007）。

在本研究中，16S rDNA V3区的PCR-DGGE图谱能够很好地对肉鸡呼吸道中的细菌进行区分，虽然数据不能代表所有肉鸡呼吸道内细菌群落的情况，但可以说明PCR-DGGE技术能够有效地用于呼吸道菌群的分析。其DGGE图谱可以反映菌群的组成情况，同时结合图谱中条带的序列分析，还可以了解具体的优势菌群的种类。

在畜禽养殖中，应用PCR-DGGE技术可建立一种不依赖传统分离培养技术而能原位揭示畜禽体内细菌种群组成的分子诊断技术和病原菌分子诊断技术。通过检测畜禽呼吸道正常微生物区系组成，建立基于机体内优势菌群结构的健康畜禽动物评价技术，还可检测畜禽动物呼吸道微生物的动态变化和病害后微生物区系组成的差异，以及使用微生态制剂前后微生物区系组成的差异。通过对畜禽呼吸道内细菌种群结构的揭示，为新的畜禽微生物制剂菌株的开发和应用提供候选菌株和理论基础。

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