红景天苷对非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝组织氧化应激的抑制作用

戴 宁， 邹 原， 王慧芳， 戴木根

(大连医科大学 1附属第一医院消化内科，2消化生理实验室，辽宁 大连 116011)

红景天苷对非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝组织氧化应激的抑制作用

戴 宁1△， 邹 原2， 王慧芳1， 戴木根1

(大连医科大学1附属第一医院消化内科，2消化生理实验室，辽宁 大连 116011)

目的观察红景天苷(salidroside ,SDS)对大鼠非酒精性脂肪性肝炎(NASH)肝组织氧化应激的影响。方法以高脂高胆固醇饮食14周诱导建立大鼠NASH模型，药物干预组在造模第8周末时给予SDS 300 mg·kg-1·d-1体重灌胃连续6周，在14周末检测大鼠血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)，以及肝组织TC、TG、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽(GSH)含量的变化，ELISA检测8-异前列腺素F2α(8-iso-PGF2α)的水平变化， HE染色观察肝组织病理学变化，免疫组化观察8-羟基脱氧鸟苷酸(8-OHdG)表达的变化。结果在14 周末， NASH模型组大鼠肝组织病理学检查显示肝组织呈中重度脂肪变性并同时伴有炎症细胞浸润；与正常对照组相比，NASH模型组大鼠血清ALT、AST、TG和TC，以及肝TG、TC和MDA的含量显著上升，而肝SOD和GSH的含量显著下降，8-iso-PGF2α的水平显著上升，免疫组化显示8-OHdG表达的阳性细胞数显著增多。与模型组相比，SDS药物干预组大鼠ALT、AST、TG、TC、MDA和8-iso-PGF2α的含量均显著下降，而肝SOD和GSH的含量显著上升，肝病理学变化得到显著改善，8-OHdG表达的阳性细胞数明显减少。结论SDS对高脂高胆固醇饮食诱导的NASH有较好的抑制效果，其机制可能与SDS的抗氧化作用有关。

非酒精性脂肪性肝炎； 红景天苷； 氧化性应激； 大鼠

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一种无过量饮酒史，以肝细胞弥漫性大泡性脂肪变性和脂质储积为主要特征的临床病理综合征，是肥胖、Ⅱ型糖尿病、高血压病、高脂血症等代谢综合征在肝脏中的病理表现。NAFLD的病理变化随肝病的进展而表现有单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎、脂肪性肝纤维化以及肝硬化、终末期肝衰竭。其中，非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis, NASH)是NAFLD进展为肝纤维化、肝硬化乃至终末期肝病的高危因素，积极探索NASH的防治研究对改善NAFLD的病程进展及预后具有重要意义。目前，较多的研究均证实NASH肝组织活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生过多和抗氧化防御系统的失衡产生的氧化应激(oxidative stress)在NASH的发病机制中起关键作用[1]。红景天苷(salidroside, SDS) 是青藏高原特有植物红景天的主要药效成分。以往的研究表明，红景天苷具有较强的抗氧化及良好的抗肝损伤作用。为此, 我们以高脂高胆固醇饮食诱导NASH大鼠模型，从清除氧自由基这一角度出发探讨红景天苷防治NASH的作用机制。

材 料 和 方 法

1材料

1.1动物 清洁级雄性SD大鼠30只，体质量(140±20)g，由大连医科大学实验动物中心提供，合格证号为SCXIC(辽)2008-0002。

1.2实验用药 红景天苷由陕西森弗高科实业有限公司提供(纯度﹥98%)。每毫升蒸馏水中加入50 mg红景天苷粉剂配制成混悬液备用。

1.3主要试剂 丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(aspartate transaminase，AST)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)和丙二醛(malondialdehyde， MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase， SOD)和谷胱甘肽(glutathione, GSH)测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。大鼠8-异前列腺素F2α(8-isoprotstaglandin F2α,8-iso-PGF2α)ELISA试剂盒购自R&D。鼠抗8-羟基脱氧鸟苷酸(8-hydroxydeoxyguanosine，8-OHdG)为Abcam。链霉抗生物素蛋白-过氧化物酶(streptavidin-peroxidase,SP)染色试剂盒和浓缩型二甲基联苯胺(diaminobenzidine,DAB)试剂均为福州迈新生物技术公司产品。

2方法

2.1大鼠NASH模型建立及动物分组 30只大鼠正常喂养1周后，随机将其分为正常饲料组(n=10)和高脂高胆固醇饲料(87%正常饲料+15%猪油+2%胆固醇)组(n=20)。饲喂8周，将高脂饲料组大鼠再随机分为NASH模型组(n=10)和药物干预组(n=10)，在继续饲喂高脂高胆固醇饲料的同时，药物干预组给予红景天苷水溶液300 mg·kg-1·d-1灌胃，每天1次，共6周。大鼠分笼饲养于(24±2)℃室温、明暗各12 h的动物实验室内。实验动物每3 d称量体重1次，并根据体重调整用药剂量。在第14周末，大鼠隔夜禁食12 h，3%戊巴比妥钠麻醉处死所有动物，迅速按常规分离血清，采血后迅速摘取肝脏称重，-80 ℃ 冷冻保存。测定时将低温保存的肝组织标本于4 ℃冰箱中解冻, 加10 倍的HEPES 缓冲液匀浆，以3 000 r/ min 离心15 min，-4 ℃保存上清待测。

2.2血清和肝脏生化指标的检测 血清ALT、AST、TG、TC和肝匀浆TG、TC、MDA、SOD、GSH含量的检测，严格按试剂盒要求规范操作。

2.3肝8-iso-PGF2α含量的测定 使用双抗体夹心ELISA法检测肝组织中8-iso-PGF2α含量，主要试剂包括纯化的羊抗兔IgG 抗体包被的微孔板、8-iso-PGF2α标准物、抗血清和胆碱酯酶标记的抗原等。定量检测在酶标仪(Bio-Rad)上进行，严格按试剂盒要求规范操作。检测结果以每克肝组织8-iso-PGF2α的含量(ng/g) 表示。

2.4病理形态学观察 肝组织10%甲醛固定，常规制备组织石蜡切片，HE 染色。在200 倍光镜下根据NAFLD 活动度积分(NAFLD activity score，NAS)标准进行评分，肝细胞脂肪变评分：0 分(肝实质内脂变肝细胞占总细胞的比例<5%)；1 分(5%～33%)；2 分(34%～66%)；3 分(>66%)。小叶内炎症(200 倍镜计数坏死灶)：0 分(无)；1 分(<2 个)；2 分(2～4 个)；3 分(>4 个)。肝细胞气球样变：0 分(无)；1 分(少见)；2 分(多见)。3项积分之和为NAFLD。NAS>4 分则诊断为NASH，3～4 分为可疑NASH[2]。

2.5肝8-OHdG免疫组织化学染色 甲醛固定的肝组织进行常规石蜡包埋、切片脱蜡至水， 95 ℃微波15～20 min组织抗原修复； 3%过氧化氢溶液中室温孵育5～10 min，阻断内源性过氧化物酶，用PBS冲洗3次，兔血清封闭，加Ⅰ抗anti-8-OHdG(工作浓度1∶100)，4 ℃过夜，PBS冲洗3次，加生物素标记的Ⅱ抗，37 ℃孵育15 min，PBS冲洗3次，加SP溶液，37 ℃孵育15 min，PBS冲洗3次， DAB显色，苏木素复染，脱水，透明，封片。以PBS代替Ⅰ抗作阴性对照。结果判定：以细胞核和细胞浆染成棕黄色为阳性细胞。采用Image-Pro Plus 5.1专业图像分析软件分析免疫组化染色结果。所有切片在200倍光镜下对免疫组化染色的阳性表达进行定量分析，计算阳性染色的平均积分吸光度(MIA)。MIA=积分吸光度(IA)/测量区域面积。上述各组大鼠免疫组化检测过程均采用盲法进行。

3统计学处理

采用SPSS 13.0 统计软件进行单因素方差分析，计量资料用均数±标准差(mean±SD)表示，组间比较用LSD检验，以P<0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1红景天苷对大鼠血清ALT和AST活性的影响

在第14周末，NASH模型组大鼠反映肝细胞损伤的ALT和AST显著高于正常饲料组；与模型组相比，红景天苷则能显著降低NASH大鼠升高的ALT和AST,见表1。

2红景天苷对大鼠血清和肝脏脂质的影响

在第14周末，NASH模型组大鼠血清和肝脏TG和TC的含量显著高于正常饲料组；与模型组相比，红景天苷则能显著降低NASH大鼠升高的TG和TC,见表1、2。

表1 各组大鼠血清ALT、AST、TG和TC含量变化的比较

#P<0.05,##P<0.01vscontrol group；*P<0.05,**P<0.01vsNASH model group.

表2各组大鼠肝脏TG和TC含量变化的比较

Table 2. Effects of SDS (300 mg·kg-1·d-1) on liver levels of TG and TC in NASH rats (mmol/L.Mean±SD.n=10)

GroupTGTCControl1.51±0.090.95±0.12NASHmodel2.43±0.12##1.96±0.07#SDStreatment1.52±0.13**1.01±0.05*

#P<0.05,##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsNASH model group.

3红景天苷对大鼠肝脏氧化和抗氧化状态的影响

在第14周末，NASH模型组大鼠肝脏MDA的含量显著升高， 抗氧化剂SOD和GSH的含量显著低于正常饲料组；与模型组相比，红景天苷则能显著抑制NASH大鼠肝MDA的升高，同时明显提高肝SOD和GSH的含量，见表3。

4红景天苷对大鼠肝脏8-iso-PGF2α含量的影响

在第14周末，NASH模型组大鼠肝脏8-iso-PGF2α的含量显著升高；与模型组相比，红景天苷则能显著抑制NASH大鼠肝8-iso-PGF2α的升高，见表3。

表3各组大鼠肝脏MDA、SOD、GSH和8-iso-PGF2α含量变化的比较

Table 3. Effects of SDS (300 mg·kg-1·d-1) on liver levels of MDA, SOD, GSH and 8-iso-PGF2αin NASH rats (Mean±SD.n=10)

GroupMDA[μmol/(gprotein)]SOD[103U/(gprotein)]GSH[mg/(gprotein)]8-iso-PGF2α(ng/g)Control0.61±0.22101.51±2.5813.15±2.6576.61±29.21NASHmodel1.71±0.23##46.42±9.31##6.48±1.25##197.51±98.66#SDStreatment0.67±0.18**97.21±3.52**12.23±1.32**90.76±74.52*

#P<0.05,##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsNASH model group.

5红景天苷对大鼠肝组织病理学变化的影响

光镜下HE染色显示，在第14周末， NASH模型组大鼠肝脏呈现中、重度肝细胞脂肪变性，同时伴有小叶内炎症细胞浸润及点状坏死，但未见明显的肝纤维化改变；而红景天苷则能显著逆转NASH肝病理学的改变，光镜下可见有少量的脂滴，浸润的炎症细胞消失，见图1。NASH模型组大鼠NAS明显高于正常组，与模型组比，红景天苷组NAS显著降低，见表4。

6红景天苷对大鼠肝组织8-OHdG免疫组化的影响

正常饲料组大鼠肝组织偶见散在微弱的8-OHdG 阳性表达细胞，NASH模型组大鼠肝组织可见大量的8-OHdG阳性表达细胞，胞核胞浆均有表达，而红景天苷组8-OHdG阳性表达细胞数显著减少，见图2。NASH模型组大鼠MOD值显著高于正常组，与模型组比，红景天苷组MOD值显著降低，见表4。

Figure 1. Pathological changes in rat hepatic tissues from different groups (HE staining, ×200).A:control;B:NASH model;C:SDS (300 mg·kg-1·d-1) treatment.

图1各组大鼠肝脏组织病理学变化

Figure 2. Expression of 8-OHdG in rat hepatic tissues from different groups (immunohistochemical staining,×200).A:control;B:NASH model;C:SDS (300 mg·kg-1·d-1) treatment.

图2各组大鼠肝脏组织8-OHdG表达的变化

表4各组大鼠肝组织病理NAS和8-OHdG免疫组化MOD变化的比较

Table 4. Effects of SDS (300 mg·kg-1·d-1) on liver tissue NAFLD activity score (NAS) and 8-OHdG immunohistochemical mean integral absorbance (MIA) in NASH rats (Mean±SD.n=10)

GroupNASMIAControl0.00±0.000.175±0.036NASHmodel5.75±0.61##0.315±0.743#SDStreatment1.09±0.27**0.201±0.315*

#P<0.05,##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsNASH model group.

讨 论

本研究中，我们通过高脂高胆固醇饮食持续喂养SD大鼠14 周，成功建立了NASH大鼠模型。NASH大鼠血清ALT、AST、TG、TC及肝脏TG、TC的含量均显著升高，病理显示肝脏组织出现中重度弥漫性肝细胞脂肪变性，伴有炎症细胞浸润和坏死等特征，符合NASH的病理学改变[2]。

目前，NASH的发病机制尚不十分清楚。大量研究认为，NASH的发病过程经历“二次打击”。其中，各种因素引起的肝细胞脂肪积聚和脂肪变性作为“初次打击”，而脂肪肝的形成则降低了肝细胞的解毒功能，使肝细胞对额外打击(如活性氧自由基等)的敏感性上升，更易产生严重的肝组织损伤；第二次打击则以氧化应激/脂质过氧化损伤为中心，高脂高胆固醇饮食可使NASH肝组织的氧化应激增强，导致单纯性脂肪肝进一步发展为脂肪性肝炎、肝纤维化甚至肝硬化,而抑制NASH的氧化应激，则能有效防治NASH及其肝纤维化的发生发展[3]。肝细胞含有丰富的线粒体，NAFLD时，肝细胞线粒体的形态、功能均发生了变化，是肝组织ROS的重要来源[4]。其次，NASH时肝细胞色素P450 2E1的表达上调则是ROS的另一重要来源[5]。过多的ROS攻击生物膜而发生脂质过氧化反应，使其主要产物MDA的含量增加；同时耗竭SOD、GSH等肝细胞内重要的抗氧化酶，促使氧化物与抗氧化物之间的动态平衡失调，出现氧化应激，氧应激可进一步刺激肝星状细胞分泌细胞外基质而导致肝纤维化的发生[6]。8-iso-PGF2α是细胞膜上花生四烯酸发生脂质过氧化作用后的产物。由于这一过程不需要酶催化, 在体内含量非常稳定, 故被认为是判断活体内自由基氧化强度和临床上作为评价抗氧化剂疗效的最理想的生化指标。8-iso-PGF2α的增多, 可使细胞的完整性受到破坏、膜的流动性发生改变, 从而导致细胞的结构、功能受损, 甚至导致细胞凋亡。临床研究表明，NASH患者尿8-iso-PGF2α的含量显著增多，并与肝组织炎症和线粒体异常呈现显著的相关性[7]。8-OHdG是细胞DNA氧化损伤的标志，过多的ROS攻击DNA，导致DNA链断裂、碱基修饰等氧化性DNA损伤，形成DNA加合物8-OHdG。8-OHdG累积最终引起细胞基因突变和癌发生，是原发性肝癌发生的独立危险因素[8]。NASH患者肝组织8-OHdG的表达显著高于单纯性脂肪肝[9]。抗氧化剂抑制8-OHdG的表达上调能有效治疗NASH及伴随的肝脏肿瘤的发生[10]。

我们的实验结果表明，红景天苷能显著降低高脂高胆固醇饮食诱导的NASH大鼠升高的血清ALT、AST、TG、TC及肝脏TG、TC的含量，有效逆转NASH的肝脏脂肪变性和炎症改变，同时能显著降低NASH肝组织的ROS,抑制8-iso-PGF2α的上升,拮抗肝细胞DNA的氧化损伤，并提高肝组织抗氧化酶的含量，表明红景天苷对NASH大鼠良好的防治作用可能与其较强的抗氧化作用有关。

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Inhibitoryeffectofsalidrosideonliveroxidativestressinratswithnon-alcoholicsteatohepatitis

DAI Ning1, ZOU Yuan2, WANG Hui-fang1, DAI Mu-gen1

(1DepartmentofGastroenterology,theFirstAffiliatedHospital,2LaboratoryofDigestivePhysiology,DalianMedicalUniversity,Dalian116011,China.E-mail:dainingdn@163.com)

AIM: To explore the effects of salidroside (SDS) on the oxidative stress in liver tissues from rats with non-alcoholic steatohepatitis (NASH).METHODSThe experimental animal model of NASH was established in SD rats fed on high-fat and high-cholesterol diet (HFHCD) for 14 weeks. SDS (300 mg·kg-1·d-1) was administered via gavage daily from the 8th week after HFHCD feeding. At the end of the 14th week, serum samples were taken for detection of alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), triglyceride (TG) and total cholesterol (TC). Liver tissues were taken for TG, TC, malondialdehyde (MDA), superoxide dismutase (SOD) and glutathione (GSH) detection. The content of 8-isoprostaglandin F2α(8-iso-PGF2α) in liver tissues was determined by ELISA. The liver histopathological changes were observed under microscope with HE staining. The expression of 8-hydroxydeoxyguanosine (8-OHdG) in liver tissues was determined by immunohistochemical staining.RESULTSAt the end of the 14th week, ALT, AST, TG and TC in serum, and TG, TC, MDA and 8-iso-PGF2αin liver homogenate in NASH model group were significantly increased compared with control group, while SOD and GSH in liver tissues were significantly decreased. The liver expression of 8-OHdG in NASH model group was higher than that in control group. Compared with NASH model group, SDS significantly inhibited the elevation of serum ALT, AST, TG and TC, and liver TG, TC, MDA and 8-iso-PGF2α, but increased the levels of SOD and GSH in liver tissues. Meanwhile, the liver histopathological score and 8-OHdG expression were decreased in SDS treatment group.CONCLUSIONSalidroside can effectively inhibit steatohepatitis induced by HFHCD, and its antioxidant effect may be one of the mechanisms.

Non-alcoholic steatohepatitis; Salidroside; Oxidative stress; Rats

R575.5

A

1000- 4718(2013)09- 1704- 05

2013- 04- 23

2013- 07- 11

△通讯作者 Tel:0411-83635963-2173; E-mail: dainingdn@163.com

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.09.030