刺梨籽油的脂肪酸组成和抗氧化活性研究*

史亚男，王道平，马 琳，游泽芳，杨小生*

(1.贵州师范大学化学材料与科学学院，贵州贵阳550002;2.贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室，贵州贵阳550002)

刺梨(Rosa roxburghii Tratt)为蔷薇科植物，其果实酸、涩、平，具有消食健脾、收敛止泻、解暑等功效，用于治疗痢疾、积食腹胀、肠炎、遗精和维生素C缺乏症［1］。贵州、广西等省区有丰富刺梨资源，人工和野生栽培产量均较大。近代药理研究证明，刺梨具有防癌［2］、提高免疫和抑制肿瘤生长［3］、抗动脉粥样硬化［4］以及清除自由基、抗突变等作用［5］。刺梨的化学成分除了维生素类［6］和微量元素外，还含有黄酮成分、硬脂酸、B－谷甾醇［7］、三萜类化合物［8－11］。刺梨籽为刺梨的果实子粒，在刺梨产品的加工中，基本作为废弃物丢弃，对此资源的有效利用，将对刺梨产业的循环经济发展具有重要的意义。已有研究报道刺梨籽中含有氨基酸、微量元素、脂肪酸［12］和小分子挥发性成分［13］等。本文对人工栽培刺梨果榨汁后刺梨籽油中总脂肪酸、结合型脂肪酸和游离型脂肪酸经甲酯化后，进行较为系统的分析测试，开展刺梨籽油的抗氧化活性研究，为刺梨籽油的深度开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料与试剂 样品采自贵州省龙里县刺梨人工栽培基地(经贵州大学安华明教授鉴定为Rosa roxburghii)。二苯代苦味基肼自由基(DPPH·)购于百灵威公司;石油醚、二氯甲烷、甲醇、正己烷、氯化钠、无水硫酸镁、硫酸、无水乙醇、H2O2、硫酸亚铁、邻二氮菲、氢氧化钠、磷酸二氢钾均为国产分析纯试剂。

1.2.2 仪器与设备HP6890/HP5975C GC/MS联用仪(美国安捷伦公司);HP－8453型紫外可见分光光度计(惠普公司);FA114型电子天平(上海海康电子仪器厂);旋转蒸发仪(上海亚荣);恒温水浴锅(上海申生科技有限公司);DZ－2A型真空干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司);粉碎机(浙江温岭市大鹏机械有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 刺梨籽油的提取 将100 g刺梨籽粉碎后连续回流提取。提取条件:温度70℃，溶剂石油醚(沸程60～90℃)，提取时间3 h(分两次)，料液比1∶15，得淡黄色澄清油状液体6.6 g，提取率为6.6%。

刺梨籽油结合型脂肪酸与游离型脂肪酸的制备［14］:取刺梨脂肪油500 mg，用5%的Na2CO3水溶液(100 mL)分散，同置于分液漏斗中振摇后，加入正己烷100 mL萃取，分离出正己烷层。正己烷层用水洗至中性，用无水MgSO4干燥，滤去Mg-SO4，回收正己烷，得到结合型脂肪酸(256 mg);水层先用2N HCl酸化，再用正己烷萃取，萃取层用水洗至中性，无水MgSO4干燥，滤去MgSO4，回收正己烷，即得到游离型脂肪酸(197 mg)。结合型脂肪酸与游离型脂肪酸的比例为1.3∶1。

脂肪酸的甲酯化:(1)刺梨籽油总脂肪酸甲酯化［15］:取干燥后的刺梨籽油200 mg，加入4.3 mL H2SO4/甲醇溶液(2.5 mol/L)，溶液置于反应瓶中，70℃水浴条件下反应30 min，反应结束后加入正己烷萃取，取上清液进行GC－MS分析;(2)游离型脂肪酸的甲酯化［15］:取干燥后的刺梨籽油游离型脂肪酸132 mg，加入3 mL H2SO4/甲醇溶液(2.5 mol/L)，溶液置于反应瓶中，70℃水浴条件下反应30 min。加入5 mL正己烷振摇，取上清液进行GC－MS分析;(3)结合型脂肪酸的甲酯化［16］:取干燥后的刺梨籽油结合型脂肪酸220 mg，加入5 mL KOH/甲醇溶液，在50℃水浴中振摇30 min，加入6 mL正己烷萃取，取上清液正己烷层进行GC－MS分析。

气相色谱条件:色谱柱为HP－5MS 5%Phenyl Sloane(30 m×0.25 mm×0.25 m)弹性石英毛细管柱，柱温45℃(保留时间2 min)。以3.5℃/min速度升温至220℃，保持2 min。汽化室温度250℃，载气为高纯He(99.999%)，柱前压7.62 psi，载气流量1.0 mL/min，分流比20∶1。

质谱检测条件:离子源为EI源;离子源温度280℃;四级杆温度150℃;电子能量70 eV;发射电流34.6μA;倍增器电压1037 v;接口温度280℃;质量范围30～50 amu。

定性定量分析:通过HPMSD化学工作站，结合WILEY275和NIST2005质谱标准图库，并结合有关文献对化合物人工图谱解析［17－18］，按峰面积归一化法进行计算，求得各化学成分的相对质量分数。

1.2.3 刺梨籽油抗氧化活性研究DPPH·清除率的测定［19］:1，1－二苯基苦基苯肼(1，1－diphenyl－2－picrylhydrazyl，DPPH)是一种稳定的有机自由基和具有特征的紫红色团吸收峰，当存在自由基清除剂时，由于与其单电子配对而使其吸收逐渐消失，其褪色程度与其所接受的电子数成定量关系，因而可用分光法进行定量分析。

称取一定量的刺梨籽油，分别用无水乙醇配成浓度为2.5、5、10、20、40、60、80、100 mg/mL的待测溶液，吸取待测溶液2.0 mL，加入0.2 mmol/L DPPH溶液2.0 mL，摇匀，放置30 min。以无水乙醇调零，测定517 nm处的吸光值A样品。同时，测定样品溶液2.0 mL与无水乙醇2.0 mL混合液在517nm处的吸光度A对照，再测定2.0 mL DPPH溶液与2.0 mL无水乙醇在517 nm处的吸光值A空白。同一测定重复3次。对DPPH自由基的清除率按下式计算:

·OH自由基清除率的测定［20－21］:测定方法采用Fenton反应。参照YANG Xiao－ming等人的方法［21］，并略作改进。先配制0.75 mmol/L邻二氮菲无水乙醇溶液，取该液1 mL，加2 mL的0.2 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.4)，充分混匀后加入0.75 mmo l/L硫酸亚铁溶液(去离子水配制)1 mL，每加一管立即混匀，加入1 mL蒸馏水以补充体积，最后加入0.01%H2O21 mL为对照;反应液在37℃ 保温1 h，于536 nm处测定吸光度。依上法，加入0.75 mmol/L邻二氮菲无水乙醇溶液1 mL，加入2 mL的0.2 mmo l/L磷酸盐缓冲液(pH 7.4)，充分混匀后，加入0.75 mmol/L硫酸亚铁溶液1 mL，加入1 mL浓度为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL的样品为处理样;最后加入0.01%H2O21 mL。空白对照不加0.01%H2O2，以蒸馏水补充体积。每个质量浓度样品做3个平行样品。对羟自由基的清除率按下式计算:

2 结果与分析

2.1 刺梨籽油脂肪酸成分

等到玉玦啸叫停息，它射出的光芒也达到了极盛，就是这样的极盛，也只是亿万星河中的一粒，长安上元夜万千灯火中的一盏，黄梁村后池塘夏夜流萤中的一点，夏日莲花中的一瓣。只是我们的天地，又何曾忽视过一粒、一盏、一点与一瓣呢？少年们好像听到由银河里传来的一声叹息，感到纤细星光微微的悸动，大榆树轻轻震颤，积雪忽忽飘落，黄梁村像簸箕中的一粒黄豆上下跳动，跳动的轻微，连村里最灵醒的狗子与公鸡，都没有感应出来。

总脂肪酸、结合型脂肪酸和游离型脂肪酸甲酯化成分气相色谱－质谱分析结果见表1。

表1 刺梨籽油脂肪酸及含量Table 1 Components and contents of the methylated fatty acids from seed oil of R.Roxburghii

由表1可知，刺梨籽油进行甲酯化后，检测鉴定了7种成分，占其色谱峰总面积的99.3%。其中，脂肪酸成分为6种，主要成分为亚油酸甲酯(48.35%)、亚麻酸甲酯(41.12%);刺梨籽油的游离型脂肪酸经甲酯化后，检测出了7种脂肪酸成分，亚油酸甲酯(34.08%)、亚麻酸甲酯(33.42%)也为主要成分;刺梨籽油的结合型脂肪酸经甲酯化后，检测出了脂肪酸成分8种，主要成分为亚油酸甲酯(30.37%)、9－十八碳烯酸甲酯(30.41%)。在结合型和游离型脂肪酸中均检出了相对含量较高的棕榈酸和硬脂酸或其他成分，与刺梨籽油中脂肪酸成分不一致，是否为由于在脂肪酸类型分型处理时成分被富集产生的结果，有待进一步研究。

亚麻酸具有较多的保健功能，如治疗风湿性关节炎、肠炎、皮炎与牛皮癣以及哮喘、支气管炎等病症，可预防抑郁、精神分裂症与阿尔茨海默病等精神病;对自身免疫系统疾病，癌变和抑制癌细胞转移，冠心病、卒中等心脑血管疾病和糖尿病等有预防作用［22］。亚油酸具有营养脑细胞、调节植物神经、抑制肿瘤转移、降低冠心病发病率、提高免疫力等功效［23］。亚麻酸和亚油酸是人体必需的脂肪酸，在人体内可以转变为花生四烯酸，对于合成磷脂，形成细胞结构，维持一切组织的正常功能，以及对于合成前列腺素，都是必要的［24］。

刺梨籽油中含有丰富的以亚油酸和亚麻酸为代表的不饱和脂肪酸，可作为功能性油料来开发利用。

2.2 刺梨籽油抗氧化活性研究

2.2.1 DPPH清除率的测定 从图1可知，随着刺梨籽油浓度的增加，清除DPPH自由基的能力均呈上升趋势，当刺梨籽油的溶液浓度为80 mg/mL时，清除率为61.54%，为一拐点。清除率与刺梨籽油的浓度成量效关系。刺梨籽油具有强的DPPH自由基清除能力，这可能与刺梨籽油中含有大量的不饱和脂肪酸有关。

2.2.2 羟基(OH)自由基清除率测定 采用Fenton反应，对刺梨籽油清除羟自由基能力进行测定，结果见图2。从图2可知，随着刺梨籽油浓度的增加，清除羟基自由基的能力上升趋势明显，当溶液浓度均有2 mg/mL时，清除率为96.82%，显现量效关系。

图1 刺梨籽油DPPH清除率Fig.1 Scavenging effects of R.Roxburghii seed oil on DPPH free radical

图2 刺梨籽油·OH自由基清除率Fig.2 Scavenging effects of R.Roxburghii seed oil on·OH radical

在正常情况下，机体内活性氧化物的产生和消除系统处于动态平衡，由于各种原因，导致活性氧化物增多，和/或机体清除活性氧化物能力下降，机体就会出现氧化应激现象。当机体处于氧化应激状态时，体内组织细胞活性氧化物含量相对增加，对机体造成伤害。抗氧化剂或自由基清除物对细胞氧化损伤能较好地保护。本文发现刺梨籽油具有清除羟基自由基、DPPH自由基的能力，抗氧化活性效果显著。

3 讨论

3.1 对刺梨籽油进行甲酯化，并检测鉴定了7种成分，明确了脂肪酸成分为6种，主要成分为不饱和脂肪酸亚油酸和亚麻酸。刺梨籽油中的脂肪酸，无论是结合型还是游离型脂肪酸，均以亚油酸为代表的不饱和脂肪酸为主;刺梨籽油能有效清除羟基自由基、DPPH自由基，且对前者效果更佳，抗氧化活性显著，当刺梨籽油的浓度为2 mg/mL时，对羟基自由基的清除率达96.82%。因此，刺梨籽油可作为一种富含不饱和脂肪酸的功能性食用油脂来深度开发利用。

3.2 本文涉及的刺梨总脂肪油中的脂肪酸组分比朱海燕［14］等报道的脂肪酸成分少且主要成分油酸未检测到，可能与提取处理方法等有关，需要进一步探讨。

3.3 刺梨籽油脂的游离脂肪酸、结合脂肪酸中Hexadecanoic acid methyl ester含量较高，但在总油脂中未检测到，是否与脂肪酸的甲酯化处理后富集有关，有待进一步探究。把刺梨籽的总脂肪油用碱处理分成结合型脂肪酸和游离型脂肪酸，并对它们进行分析，有利于脂肪酸油的比较研究。对于甲酯化处理方法的条件优化，有待深入研究。

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