吴茱萸碱对SGC－7901 细胞周期和细胞凋亡的影响

张元新，葛雅琨

(吉林化工学院化工与生物技术学院，吉林省吉林市 132022)

吴茱萸是芸香科植物吴茱萸、石虎及梳毛吴茱萸成熟的果实［1］。吴茱萸碱(Evodiamine，Evo)是从吴茱萸中提取出的主要活性生物碱之一，其分子式为C19H17N3O。近年来的研究表明吴茱萸碱对多种肿瘤细胞，如肾癌细胞［2］、前列腺癌［3］、乳腺癌［4］、黑色素瘤［5］，宫颈癌［6］，胃癌［7］，结肠癌［8］等具有抑制作用。

胃癌是世界上最常见的癌症之一，仅次于肺癌，位居第二，每年全球大约有800，000人死于此病［9］。其中大约有三分之二的新生病例和死亡病例是发生在欠发达国家和地区。日本、中国、韩国、中南美洲、东欧以及中东部分地区是胃癌的高发区;而北美、澳大利亚、新西兰、北欧和印度的发病率较低［10－11］。胃癌患者的五年的生存率不足20%。对于那些早期诊断的患者，应用内窥镜粘膜切除术(Endoscopic mucosal resection，EMR)可以对其进行治疗;目前这种外科手术的方式也只能治愈不到40%的病例，大多数胃癌都发生了转移，最后只能依靠辅助化疗的方式对其进行治疗。对晚期和复发的患者，化疗成了主要治疗手段。因此，高效、低毒并具有新作用机制的抗肿瘤药物的研究迫在眉睫。本研究探讨了吴茱萸碱诱导胃癌细胞SGC－7901 的凋亡作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

吴茱萸碱(Evodiamine)购自SIGMA 公司。Anti－Caspase 3、β－actin 抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG 抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG 抗体均购自Santa Cruz 公司;新生牛血清、DMEM 培养基购自Gibco 公司;PVDF 膜(0.22 μm)，Millipore 公司;预染蛋白Marker，购自Fermentas 公司。Annexin V－FITC/PI 凋亡检测试剂盒，BD 公司。

1.2 细胞培养

人胃癌细胞系SGC－7901 细胞购自中国科学院细胞库。SGC－7901 细胞用含10%的新生牛血清的DMEM 培养基，5% CO2、37℃、饱和湿度的恒温孵育箱培养。

1.3 MTT 实验

将对数生长期的细胞SGC－7901 以5 × 103个/孔浓度接种于96 孔板中培养过夜。用吴茱萸碱(0.000001～100μM)处理SGC－7901 细胞48 h。每个浓度3个复孔，并设空白对照和阴性对照孔。细胞加药处理后的时间点，分别加入5 mg/ml 的MTT 20 μL，37℃继续孵育4 h。轻轻吸去孔内的培养基，每孔加入150μl 的二甲基亚砜(DMSO)。在酶标仪中震板10 min，测定490 nm 的光吸收值。计算存活率和抑制率，公式如下:

存活率=实验组OD 平均值/对照组OD 平均值×100%.

抑制率=(对照组OD 平均值－实验组OD 平均值)/对照组OD 平均值 × 100% .

1.4 细胞凋亡与细胞周期

将对数生长的细胞以每孔4 × 105个接种于六孔板中，贴壁培养过夜后，按照设计的不同药物浓度(0.01～100μM)处理细胞。在药物的作用时间点，把细胞培养液吸出至一个合适的离心管内，PBS 洗涤贴壁细胞一次，加入适量的胰酶消化细胞，37℃孵育2 min，用含血清的培养基终止消化，轻轻吹打细胞，合并在同一离心管中，但避免胰酶的过度消化。1500 rpm，离心3 min，弃上清，收集细胞，用PBS 轻轻重悬细胞并计数。1500 rpm，离心3 min，弃上清，用1 × Loading Buffer 将细胞配成浓度为106 的细胞悬液。取100 μl 细胞悬液分别依次加入5 μl Annexin Ⅴ－FITC和5 μl PI，轻轻混匀后置于室温下避光染色15 min。向每个染色样品中加入400 μl 1 × Loading Buffer，用200 目筛网过滤后即可进行凋亡测定。同时另一份样品加入预冷的1 ml的70% 乙醇在4℃固定12 h 以上。1500 rpm，离心3 min，弃上清，并用预冷的PBS 清洗一次，将液体尽量除尽，加入200 μl 染液(25 mg/ml RNase A 4 μl，PI 20 μl，PBS 186 μl)，37℃孵育30 min，筛网过滤后即可用于细胞周期测定。

1.5 Western－blot

细胞加药处理后，用预冷的PBS 洗2～3 遍、计数，按2 ×106 细胞加入含蛋白酶抑制剂的裂解液100 μl，在冰上裂解30 min，12000 rpm，4℃，离心10 min，收集上清，进行蛋白定量。含50 μg 总蛋白的样品溶液作为上样量，加入5 × SDS Loading Buffer，然后放在金属浴中100℃煮沸10 min 使蛋白变性。经SDS－PAGE 电泳、转膜后，移入用TBST 配制的含5% 脱脂奶粉的封闭液中，室温封闭1 h。加入相应的一抗、二抗孵育，用ECL 发光法检测不同蛋白的表达情况。

1.6 统计学分析

所有实验重复3 次，应用SPSS 11.0 软件进行统计分析，实验结果以(x± s)表示，以P ＜0.05 具有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 吴茱萸碱对SGC－7901 细胞增殖的影响

为了检测吴茱萸碱对SGC－7901 细胞增殖的影响，分别用吴茱萸碱(0.000001－100μM)处理SGC－7901 细胞48 h。结果表明吴茱萸碱对SGC－7901 细胞的抑制作用具有明显的量效关系，10μM 的吴茱萸碱对其细胞的抑制作用为53.6 ±1.3%(图1)。

图1 吴茱萸碱对SGC－7901 细胞增殖的影响

2.2 吴茱萸碱对SGC－7901 细胞周期的影响

细胞增殖的抑制作用往往与细胞周期的变化密不可分。因此，我们分别用吴茱萸碱(0.01，0.1，1，10，100μM)处理胃癌细胞SGC－7901 48 h，用流式细胞仪检测细胞周期分布进行情况。结果表明，吴茱萸碱诱导SGC－7901 细胞产生了明显的G2/M 期阻滞现象。当吴茱萸次碱的浓度为0.1μM时，G2/M 期细胞的比例为19.56 ± 0.98%;当吴茱萸次碱的浓度为1μM时，G2/M 期细胞的比例为41.47 ±1.07%;当吴茱萸碱的浓度达到10，100μM时，G2/M 期细胞的比例分别为88.81 ±1.44%、99.61 ±1.98% (图2)。这种G2/M 期细胞的增加也同时伴随着G1、S 期细胞的不断减少。

图2 吴茱萸碱对SGC－7901 细胞周期的作用

图3 吴茱萸碱诱导SGC－7901 细胞凋亡

2.3 吴茱萸碱对SGC－7901 细胞周期的影响

吴茱萸碱对SGC－7901 细胞产生了明显的抑制作用及G2/M 期阻滞，然而其是否能直接导致其细胞凋亡却是未知的。我们用吴茱萸碱(0.01，0.1，1，10，100μM)处理胃癌细胞SGC－7901 48 h，用流式双染法检测其诱导凋亡情况。结果表明1μM 的吴茱萸碱作用48h 后，其凋亡比例为39.86 ±1.19%;10μM 的吴茱萸碱作用48h 后，其凋亡比例为43.91 ±1.2%;100μM 的吴茱萸碱作用48h 后，其凋亡比例为59.62 ±1.28%。Western－blot分析结果表明，procaspase 3 的表达量随着吴茱萸碱的作用浓度的增加而逐渐下降，进而激活了caspase 3 而诱导SGC－7901 细胞凋亡。

3 结论

吴茱萸碱是一类喹诺酮类生物碱，作为一种新型的癌症化疗辅剂，它可以提高化疗效力及降低副反应的作用。日益增多的证据表明吴茱萸碱具有抑制增殖、诱导凋亡、浸润、迁移等抗肿瘤活性［12］。另一些研究检测了吴茱萸碱在小鼠、黑腹果蝇的急性毒性，其LD50分别为77.79 mg/kg、3.58 μg/adult［13－14］。本文用吴茱萸碱处理胃癌细胞SGC－7901，结果显示其具有明显的增值抑制和G2/M 期阻滞作用;并激活了caspase 3，诱导细胞凋亡。总之，本研究将为吴茱萸碱的生物活性研究和临床实验研究提供有效的实验数据。

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