光电结合应激法对糖尿病大鼠心理应激病证结合模型制作的实验研究

叶茂茂，李慧吉，武 成，潘从清，姜 睿

(1.北京市中关村医院，北京 100190;2.天津中医药大学，天津 300193;3.天津中医研究院，天津 300120;4.天津代谢病医院，天津 300070;5.天津中医药大学第二附属医院，天津 300150)

应激是身体受到强烈刺激和处于紧张状态时出现的一系列非特异性的全身反应。心身医学的研究中，应激是一个基本因素，引起应激的刺激叫应激原，有多种分类，比如心理性、躯体性，而平时所指心身疾病应激多指心理应激。在实验研究中，动物应激的操作而多趋于躯体应激，心理应激因动物与人类心理状态不同而涉及少、难度大。本动物模型制作为动物糖尿病状态下心理应激模型的制作进行探讨，为糖尿病的后续实验研究做准备。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

健康雄性wistar大鼠78只，SPF级，体质量180～200g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。常规适应性喂养1周，饲以全价动物饲料，自由饮水，动物室内自然光照，通风良好，室温保持在24℃，无其他不良刺激。

按体重随机分为正常组23只，糖尿病组55只。

糖尿病模型制作过程中，糖尿病组死亡10只，筛除血糖不符合标准的15只。

随后，进行应激实验时，正常组按体重、糖尿病组按血糖随机分为以下几组。

1.2 主要试剂及仪器

链脲佐菌素(STZ)美国Sigma公司出品，批号S-0130;优利特尿糖试纸;ONE TOUCHⅡ型血糖仪，血糖试纸美国雅培制药有限公司;参照严氏等［1］的方法自制光电刺激实验箱:塑料实验盒外径22×6×8cm，壁厚0.3cm，盒内前部装一个氖泡，氖泡下方安装一个反光镜，共20个连在一起，为自动控制的电源箱。

1.3 模型制作

1.3.1 糖尿病造模方法 参考文献实验性肥胖及糖尿病大鼠模型制作方法［2］制作模型，糖尿病组大鼠一次性尾静脉注射链脲佐菌素(STZ，溶解于0.1mol/l的柠檬酸钠缓冲液中，pH值4.0)，30mg/kg;正常组大鼠注射0.1mol/l的柠檬酸钠缓冲液，30mg/kg，正常饮食。

2周后，糖尿病组饲料由全价动物饲料改为自制高脂饲料，配方为碳水化合物50%，脂类25%，蛋白质17%，麸皮7%，盐0.5%，酵母粉0.5%［3.4］。3周后追加注射1次，方法同前。再5周后测糖尿病大鼠血糖，参考文献以血糖高于16.7mmol/l为标准，纳入实验。

1.3.2 应激方法 实验动物自然光照，自由饮食，实验室隔间与饲养间隔音，光电刺激在每天上午8∶00～10∶00进行，实验分两期顺序进行:Ⅰ期(第1～7天):此期间实施应激组的大鼠每天每只分别在实验盒内待25min，一般大鼠都能自行钻入笼中，不钻者剔除。无不自行钻入笼中大鼠;Ⅱ期(第8～22天):对应激组大鼠实施光电刺激，对N+应激组、STZ+应激组给予不规则光照+不规则电击，每天每只老鼠分别在实验盒内待25min。不规则电击指电击的频率、时间随机。第22天动物禁食，只给予光照不给电击，实验后立即做情绪唤醒行为学观察，并取血测血糖。

给光、电刺激的参数:(1)光:氖炮亮时光强度35lux，持续0.2s，灭时实验盒内光强度约为 2Lux。(2)电刺激参数:波宽 2mS，频率 250Hz，串长 1s，电流分别为 0.5mA、1.0mA、3.0mA、6.0Ma。

1.4 观察内容及方法

1.4.1 血糖检测 用 ONE TOUCHⅡ型血糖仪和血糖试纸(美国雅培制药有限公司)取大鼠尾静脉血检测各组大鼠血糖，测定时间固定于8∶00～10∶00内进行，测试前各组动物禁食12h。

于应激实验第22天应激后，立即乙醚麻醉大鼠，球后静脉丛取血，离心分离取血清，葡萄糖氧化酶法检测血糖。(试剂盒由海科锐生物技术中心提供，天津代谢病医院代检测)

1.4.2 一般状态观察 包括大鼠反应性、毛色、状态、二便及饮食、体质量情况。

1.4.3 情绪唤醒实验 情绪唤醒(Emotionality，指在开放条件下动物情绪始发性程度;动物对一定刺激在行为上产生由遗传决定的非特异性情绪性反应)水平测定，评估动物自发的情绪兴奋程度［5］。对大鼠挣扎程度、发声程度及自发性排尿和排便情况进行记录。

具体做法如下:抓住鼠尾，将鼠取出笼、离地，力度以大鼠不掉下为准，然后观察30s，以评定挣扎程度、发声、排尿、排便。

(1)挣扎程度以大鼠四肢不动或轻微挣扎记0分，四肢挣扎、背部弯曲、头朝上但未达尾部记1分，剧烈挣扎、翻身至尾部记2分;(2)发声程度以大鼠被抓后无叫声或1～4次叽叽叫，间隔时间长记0分，5～10次尖叫记1分，≥10次尖叫急促记2分;(3)自发性排尿以无排尿者记0分，有排尿者记1分;(4)自发性排便以无排便者记0分，有排便者记1分。

将5项得分相加得出大鼠情绪唤醒水平每只大鼠仅作一次行为测定。

1.5 数据统计方法

实验数据以均数±标准差(珋x±s)表示，采用SPSS 11.5版本统计软件进行数据处理，统计方法采用多组间单因素方差分析。

2 结果

2.1 大鼠血糖情况比较

表1 大鼠第10周血糖、体质量比较(珋x±s)

糖尿病组大鼠血糖明显高于正常组(P＜0.01)，且高于16.7mmol/l大鼠糖尿病血糖标准，糖尿病模型成功。应激实验后各组血糖的检测结果如下:STZ+应激相对N+应激组差异有统计学意义，相对STZ组有差异。

2.2 大鼠一般状态观察(表3)

2.3 大鼠情绪唤醒实验(表4)

表4显示，由情绪唤醒实验结果可见，N+应激组相对正常组大鼠反应性相对要低，无统计学意义。STZ+应激组相对STZ组、N+应激组差异有统计学意义，其反应性明显降低，说明在糖尿病状态，应激对大鼠反应性的影响比正常状态要明显，应激更加降低了大鼠反应性。

表2 糖尿病模型制作结果

表3 大鼠一般状态变化

表4 各组大鼠情绪唤醒行为测定结果(珋x±s)

3 结论及分析

从应激实验研究看，可以分为躯体应激和心理应激。研究方法包括束缚与制动、条件反射性电击、社会剥夺(如隔离饲养)、母性行为应激(妊娠、哺乳、疼痛)、心理应激(拥挤、剥夺控制权)和条件性恐惧等［6］，多少还带有躯体应激的成分。本实验采用光电结合应激法，光和电的应激时间、频率、电的强度都是随机的，两者的搭配也是随机的，并且最后1d只光照不电击。由于前一段时间应激为光电结合，使大鼠对光产生一种和电击联系起来的恐怖心理。从心理学实验研究看，最后应激是无躯体应激(电击)的，但只给予光照时，也可以对大鼠产生应激，所以认为这种实验应激方法是区别于躯体应激的心理应激［7］。

由实验结果看到，糖尿病应激组相对糖尿病组的反应性有明显降低，具有统计学意义，说明应激对糖尿病大鼠的影响比正常大鼠要大，应激更加抑止了糖尿病大鼠的反应性。糖尿病应激组的血糖相对糖尿病组有升高趋势，应激对其也产生了影响。临床观察，糖尿病是心身疾病，其本身的发病、发展都受心理因素的影响，与实验的结果可以相参照。进一步推测对相同的心理应激事件，糖尿病病人相对正常人承受能力要差，而造成糖尿病病情发展［8］。

中医的情志学说包括七情、五志、五神等内容，它体现了现代心理学的基本心理过程。情志学说与应激理论都认为，人体在受到外界刺激时会有相应的反应，而在过量、过久的应激下会导致疾病发生。中医情志学重视主观体验和“形神合一”，应激理论侧重心理-身体的反应。两者思维相似，认为“心”“身”相关。可见，中医情志学与西方应激理论从认识方法和致病因素上都有很多相通之处。中医证候动物模型是根据中医病因病机理论，利用特定的致病因素，在动物身上复制出与人体疾病症状和病理改变相近或相似的证候。本实验根据中医情志学病因病机理论，用无规律的不良情志刺激影响了糖尿病大鼠的病理状态，既有血糖升高的糖尿病“病”的特征，又有精神萎靡、活动迟缓、毛发灰暗及行为学改变等类似人体的“气机失调证”的外在表现，基本符合病证结合模型。

本实验先用小剂量的STZ注射再加高脂饮食的方法制作糖尿病模型，在此基础上，用光电应激方法模拟了心理应激，依据中医情志学说，制作了病(糖尿病)证(气机失调证)结合的大鼠模型，为心身疾病糖尿病的进一步后续研究打下了动物模型基础，并为心理应激实验提供了参考。

［1］ 严进，王春安，叶阿莉，等.躯体性和心理性应激对大鼠血浆皮质酮变化的影响［J］.心理学报，1991，4:418-424.

［2］ 谢明智，刘海帆，张凌云，等.实验性肥胖及糖尿病大鼠模型［J］.药学学报，1985，20(11):801-8062.

［3］ 袁锦虹，刘志诚，赵玫.针刺对实验性非胰岛素依赖性糖尿病大鼠下丘脑视上核中枢的影响［J］.浙江中医杂志，2000，11:498.

［4］ 刘永玉，毛良.实验性NIDDM大鼠的胰岛素抗性［J］.中国病理生理杂志，1991，7(4):422.

［5］ 吴大兴，姚树桥，戴晓阳，等.中国地鼠情绪唤醒水平评定量表的制定［J］.湖南医科大学学报，1999，24(5):403-406.

［6］ 钱忠明，肖德生，徐斌.c-fos表达与心理应激脑机制的研究［J］.生理科学进展，1997，1:52-54.

［7］ 严进，王春安，陈宜张.心理应激引起的大鼠行为、血浆皮质酮及脑区氨基酸水平的变化［J］.第二军医大学学报，1997，18(4):330-333.

［8］ 叶茂茂，李慧吉，武成，等.心理应激对实验性糖尿病大鼠行为、血糖的影响及复方中药的干预作用［J］.江苏中医药，2007，39(9):70-72.