前列腺增生症肾虚血瘀证大鼠动物模型的建立与评价

樊新荣，颜 苗，何清湖

(1.湖南中医药大学，长沙 410007;2.中南大学湘雅二医院，长沙 410011)

前列腺增生症(Benign Prostatie Hyperplasia，BPH)是增生的前列腺压迫前列腺尿道或影响膀胱尿道口梗阻，出现尿频、排尿困难，甚则尿液无法排出的病症，是中老年男性的常见病和多发病。中医文献中虽没有 BPH这一名称，但从症状和体征来看，BPH属中医学“癃闭”范畴。中医学认为，年老体衰、肾气亏虚是 BPH的发病基础，瘀血、痰浊、湿热是基本的内因或病理基础，劳力过度、情志刺激、外感六淫、饮食不节是常见的发病诱因，本虚标实是基本病机特点。何清湖［1，2］通过审证求因、临床验证、微观辨证佐证3个层面探讨了BPH病因病机，认为肾虚是BPH发生的基本条件，血瘀是BPH病理改变的关键环节，肾虚和血瘀相互影响，构成了BPH的病理机制。目前与中医证相似的BPH动物模型报道不多，影响着中药疗效及药物机理的研究。本文成功建立了BPH肾虚血瘀证大鼠模型并进行了评价，为深入探讨中医药防治BPH的治法及作用机制奠定了实验基础，提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 健康成年雄性SD大鼠共96只，体质量在230～280g，由湖南中医药大学动物实验中心提供。饲养环境:室温为23℃ ±2℃，相对湿度为60% ±10%。

1.1.2 仪器 AG204-N型电子分析天平(瑞士梅特勒-托力多有限公司);AF100型制冰机(意大利斯科茨曼公司);Dyy-Ⅲ-6B型稳压稳流电泳仪(北京市六一仪器厂);显微手术器械(上海手术器械公司);解剖显微镜(日本OLYMPUS公司);3K18型低温离心机(德国 SIGMA公司);7001×UVI型数字彩色显微图像分析系统(英国UVI公司);GC-1500r型放射免疫计数器(科大创新股份有限公司中佳分公司);Biofuge fresco 4℃离心机(美国SORVALL公司);RM2125石蜡切片机(德国 Leica公司);MK3酶标仪(芬兰雷勃公司)。

1.1.3 试剂和药物 大鼠酸性磷酸酶(ACP)酶联免疫分析试剂盒、大鼠非前列腺特异性酸性磷酸酶(NPAP)酶联免疫分析试剂盒购自美国 R＆D公司;Trizol试剂盒购自SIGMA公司;丙酸睾丸酮注射液(Testosterone propionate，规格 25mg×10 支/盒，批号081003)，由上海通用药业股份有限公司生产;橄榄油(Olive oil)购自广州澳博贸易有限公司;前列癃闭通片(规格:0.5g×36片/盒，批号090301)，由湖南药圣堂制药有限公司生产。

1.2 模型的制备方法

本研究采用去势手术、激素注射和冰浴方法制作BPH肾虚血瘀证大鼠模型，具体操作方法如下。

1.2.1 去势手术操作 造模组的大鼠使用戊巴比妥钠，按照100mg/kg体质量的剂量，腹腔注射麻醉，5～6min后观察鼠躺倒、肌体松软，示麻醉成功。将麻醉成功的老鼠固定在手术台上，阴囊皮肤常规消毒，无菌条件下逐层切开大鼠阴囊皮肤、包膜组织、提睾肌，暴露睾丸后摘除双睾丸，结扎残端，彻底止血，然后全层缝合。对皮后，生理盐水棉球擦净阴囊外血迹，术后观察切口愈合情况，注意保持鼠笼清洁，防止切口感染。假手术组:手术方法同造模组，但仅暴露睾丸不予摘除，然后全层缝合。所有进行手术操作后的大鼠均肌肉注射青霉素注射液80IU/d，连续注射6d，预防伤口感染。

1.2.2 注射激素 将丙酸睾丸酮注射液与橄榄油按4∶1的比例兑匀，制成浓度为5mg/m1的油性液，对行去势手术的大鼠在术后第7天开始颈背部皮下注射，每只大鼠按5mg/kg的量注射，连续注射给药21d，制成BPH大鼠模型。

1.2.3 肾虚血瘀证BPH模型复制模型的复制行去势手术的大鼠在术后1周，观察伤口已愈合，未见感染现象。将大鼠下半身置于冰水中，每日不少于30 min，连续21d。然后从模型组随机抽取2只大鼠，取血检测血流变，处死后取前列腺组织，看是否有出血或瘀血块以确定血瘀证造模成功。

1.2.4 动物分组 各组大鼠按下述方法给药(1)空白组:普通饲养，自29d起给予0.1ml/kg/d生理盐水灌胃，每日1次，连续4周;(2)假手术组:普通饲养，自29d起给予0.1ml/kg/d生理盐水灌胃，每日1次，连续4周;(3)模型组:造模成功后第2天，给予0.1ml/kg/d生理盐水灌胃，每日1次，连续4周;(4)前列癃闭通片干预组(前癃组)，造模成功后第2天，按照0.625g/kg/d配备前列癃闭通片溶液灌胃，每日1次，连续4周。

1.3 评价指标及检测方法

1.3.1 血流变学检测 用吸管吸取1mL全血，于自清洗旋转式黏度仪测定全血黏度各切变率和血浆黏度。

1.3.2 前列腺湿重检测及指数的计算 取出前列腺仔细分离各叶前列腺，用电子天平称大鼠前列腺湿重，并根据电子分析天平测量的大鼠体质量计算前列腺指数。前列腺指数=前列腺湿重(mg)/体质量(g)×100%。

1.3.3 前列腺组织细胞形态学观察 (1)脱水及包埋:将固定好的前列腺组织经常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋;(2)切片:连续切片，片厚5μm，每隔20张取蜡带贴于涂有蛋白甘油的载玻片上;(3)HE染色:常规苏木精—伊红染色、脱水、透明、封片;(4)观察:光学显微镜下观察前列腺的细胞形态学改变。

1.3.4 血清前列腺特异性酸性磷酸酶(PAP)含量的检测 腹主动脉取血加入肝素钠抗凝，15min后用低温离心机离心10min(3000r/min)，分离血清置于 －20℃冰箱内保存，采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定总酸性磷酸酶(ACP)和非前列腺特异性酸性磷酸酶(NPAP)。PAP=ACP-NPAP。按标准规程操作，并计算各样品中PAP的含量。

1.4 统计学分析

实验数据以均数±标准差(珋x±s)表示，采用SPSS 13.0统计分析软件进行统计分析处理，多组间比较采用单因素方差分析，2组间比较采用SNK-q法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 动物基线情况

表1显示，各组大鼠实验前体重经统计学分析，P＞0.05为差异无统计学意义，具有可比性。

表1 各组大鼠体质量(珋x±s)

2.2 模型大鼠血流变学指标变化

29d后模型组、空白组、假手术组随机抽取2只大鼠，眼底静脉取血2ml，肝素抗凝后检测血液流变学指标。结果显示，模型组大鼠全血黏度、血浆黏度、红细胞聚集指数和卡松黏度均明显高于空白组、假手术组，差异有统计学意义(P＜0.05)，由此可提示大鼠血瘀证模型制造成功(见图1)。

2.3 各组大鼠体质量、前列腺湿重和前列腺指数比较

各组大鼠治疗后体质量比较显示，空白组、假手术组和模型组3组大鼠体质量差异无统计学意义(P＞0.05);前癃通组大鼠体质量降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。

图1 全血黏度、血浆黏度、红细胞聚集指数和卡松黏度柱状图注:与空白组比较:#P＜0.05，与假手术组比较:※P＜0.05

各组大鼠治疗后前列腺湿重比较显示，与空白组、假手术组比较，模型组前列腺湿重增加，差异具有统计学意义(P＜0.01);与模型组比较，前癃通组的前列腺湿重减小(P＜0.05)。

表2显示，各组大鼠治疗后前列腺指数比较显示，与空白组、假手术组比较，模型组前列腺指数升高，差异有统计学意义(P＜0.05);与模型组比较，前癃通组前列腺指数均减小 (P＜0.05)。

表2 各组大鼠体重、前列腺湿重和前列腺指数比较(珋x±s)

2.4 各组大鼠前列腺组织病理学变化的比较

图2显示，空白组前列腺上皮细胞排列清楚，腺上皮单层柱状，可见少许扁平状基底细胞及明显基底膜，腔大，腔内充满分泌物，间质、纤维组织含量无增加。假手术组与空白组形态学表现相似，间质较多炎性细胞浸润。模型组可见腺上皮皱缩，部分区域层次增加、排列紊乱，多数腺上皮呈乳头状突向腔内成锯齿状，腺体僵硬感，腔内分泌物少，间质增宽，结缔组织增生，间质纤维组织及平滑肌组织增多。前癃通组可见腺上皮增生不明显，腺腔分泌物少，间质细胞增生，但结缔组织增生不明显。

2.5 各组大鼠血清PAP含量的比较

表3显示，与空白组、假手术组比较，模型组血清PAP的含量升高(P＜0.05);与模型组比较，前癃通组血清PAP的含量降低(P＜0.05)。

3 讨论

图2 大鼠前列腺组织HE染色(×250)注:A.空白组，B.假手术组，C.模型组，D.前癃通组

国内外目前BPH模型成功报道很多，动物涉及小鼠、大鼠、兔、猫、猪、犬等，但建模方法各式各样，尚未完全统一。目前用于研究前列腺增生的动物模型有以下几种:(1)异体移植:将BPH患者病变组织异体移植到实验动物前列腺内，可形成典型的前列腺上皮和间质增生［3］;(2)转基因:将 Int-2(成纤维细胞生长因子家族成员之一)导入小鼠受精卵中可以引起前列腺腺体及膀胱增生，但未观察到前列腺间质增生［4］;(3)注射丙酸睾酮:以大鼠和犬为实验动物，肌肉注射丙酸睾酮，组织学观察大鼠前列腺上皮增生明显，而间质增生并不明显［5］;而成年犬前列腺间质增生较为明显［6］。由于肌肉注射丙酸睾酮建立大鼠模型的方法操作简单且成功率高，已成为目前最常用BPH动物模型;(4)尿生殖窦植入法:将同系胎鼠尿生殖窦植入成年雄性小鼠的前列腺，可诱导上皮和间质明显增生［7］;(5)自然增生动物模型:在哺乳动物中，只有人类和犬类才可能发生前列腺的自然增生［8］。老年犬可用作研究前列腺自然增生的动物模型［9］。迄今犬被公认为是研究前列腺增生的一种合适的动物模型［10］。但要选用前列腺增生的老年犬做实验，不仅价格昂贵且数量有限，因此用犬来做实验研究受到一定程度的限制。王毅等［11］给予去势大鼠雄激素(TP)也可建立前列腺增生症模型。用小鼠复制前列腺增生模型，具有价廉易得、方法简单可行的优点，所以也常被采用。但目前尚缺少病证结合模型，影响中药疗效及药物机理的研究，病证结合模型也是研究者们研究的热点课题之一。

表3 各组大鼠血清前列腺PAP含量的比较(珋x±s)

通过对中医文献的研究和多年从事中医男性病诊治的临床体会，何清湖教授［2］认为肾虚是 BPH发生的基本条件，血瘀是BPH改变的关键环节，肾虚和血瘀相互影响构成BPH的关键病机。进而在该认识基础上立法处方用药，获得了克癃胶囊这一治疗BPH的有效药物。本研究探讨克隆胶囊治疗BPH的作用机制，根据中医证法方药相对应的原则，首先采用去势手术复制大鼠中医肾虚证型，又据“寒则凝滞”这一理论采用冰浴方法促进瘀血形成，获得BPH肾虚血瘀证动物模型。

对模型组、空白组和假手术组的研究发现，模型组前列腺湿重、指数明显高于空白组和假手术组(P＜0.01)，模型组前列腺组织较空白组有明显增生，说明本实验制作的大鼠BPH模型是成功的。同时，模型组大鼠全血黏度、血浆黏度、红细胞聚集指数和卡松黏度均明显高于空白组和假手术组，差异有统计学意义(P＜0.05)。且模型组大鼠前列腺组织病理组织学观察可见，小血管扩张、充血，符合瘀血的病理表现，由此可以认为大鼠血瘀证模型制造成功。上述实验结果提示，课题组采用去势手术、激素注射+冰浴方法，成功复制了 BPH肾虚血瘀证大鼠模型，为中医药研究防治BPH提供了可靠、科学的实验基础和理论依据。

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