当归地上部分中绿原酸和金丝桃苷的含量测定

胡淑毅 刘东来

当归地上部分中绿原酸和金丝桃苷的含量测定

胡淑毅 刘东来

目的建立当归地上部分中绿原酸与金丝桃苷的含量测定方法。方法采用高效液相色谱法，色谱柱为GRACE C18 (250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流动相为乙腈 (A)-0.5%甲酸水溶液 (B)梯度洗脱；流速1.0 ml/min；检测波长为325 nm(绿原酸)和355 nm(金丝桃苷)。结果绿原酸和金丝桃苷的线性范围分别为0.29～5.8μg/μL(R2=0.9996)，0.1～2.0μg/μL(R2=0.9999)；平均加样回收率分别为为97.34%(RSD=4.77%)，101.70%(RSD=3.07%)。结论该方法准确可靠、简便可行，可用于当归地上部分药材的质量控制。

当归；绿原酸；金丝桃苷；含量测定

当归为伞形科植物当归Angelica sinensis (Oliv.) Diels.的干燥根，是一种常用中药，具有补血活血，调经止痛，润肠通便之功效[1]。另一方面，在亚洲各国当归还被广泛用作食材，并且在欧美也是一种重要的膳食补充剂[2,3]。随着现代医药工业的不断发展，各种中药材资源急剧减少，因此，如何合理综合利用现有资源也成了中药研究的热门课题。传统中当归的非药用部位也被深入研究，并分离得到很多具有显著活性的化学成分，并且发现当归地上部分中含有的绿原酸和金丝桃苷是重要的抗凝血及抗菌活性成分[4]。为了更好地开发利用丰富的当归地上部分资源，本文首次对其中的绿原酸和金丝桃苷含量测定方法进行了研究。

1 仪器与试剂

Waters 2695高效液相色谱系统 (包括四元泵溶剂系统，在线脱气机和自动进样器，2998 PDA 检测器，EmpowerTM工作站)；电子分析天平(BT-125D，北京赛多利斯仪器系统有限公司)；超声波清洗器(KH2200B，昆山禾创超声仪器有限公司)。绿原酸和金丝桃苷对照品购于中国药品生物制品鉴定所。甲醇为分析出，乙腈为色谱纯；水为超纯水。当归地上部分样品采自甘肃岷县，经作者鉴定为伞形科植物当归Angelica sinensis (Oliv.) Diels的干燥地上部分。

2 方法与结果

2.1色谱条件 色谱柱为GRACE C18 (250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流动相为乙腈(A)-0.5%甲酸水溶液(B)梯度洗脱 (0 ～ 30 min, 5% ～ 35%A)；流速1.0 ml/min；检测波长355 nm(金丝桃苷)，325 nm(绿原酸)；柱温25 ℃；进样量20 μl。

2.2对照品溶液的制备 精密称取干燥至恒重的绿原酸和金丝桃苷对照品适量，加70 %甲醇制成浓度分别为30 μg/ml和10 μg/ml的混合对照品溶液，即得。

2.3供试品溶液的制备 精密称取干燥药材粉末1.0 g，置具塞三角瓶中，精密加入70%甲醇50 ml，称定重量，超声45 min，放冷，再称定重量，以70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液过0.45 μm的微孔滤膜，即得。

2.4检测限与定量限 以信噪比为3:1确定绿原酸的检测限为4.0 ng，金丝桃苷的检测限为5.8 ng；以信噪比为10 ∶ 1确定绿原酸的定量限为13.5 ng，金丝桃苷的定量限为18.4 ng。

2.5线性关系考察 取干燥至恒重的绿原酸和金丝桃苷对照品适量，紧密称定，置50 ml量瓶中，以70%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成含绿原酸57.12 μg/ml，金丝桃苷21.04 μg/ml的对照品贮备液，精密吸取对照品贮备液适量，分别稀释成含绿原酸浓度为1.428，2.856，5.712，8.568，11.424，14.280，22.848，28.560，57.12 μg/ml，含金丝桃苷浓度为0.526，1.052，2.104，3.156，4.208，5.260，8.416，10.52，21.04 μg/ml的梯度对照品溶液，准确吸取上述对照品溶液各20 μl，按上述确定的色谱条件进行测定，分别以对照品的含量(X)为横坐标，峰面积积分值(Y)为纵坐标，得绿原酸回归方程为Y=282550X-841.07，R2=0.9999，线性范围0.02856～1.1424 μg；金丝桃苷回归方程为Y=128923X+735.46，R2=0.9996，线性范围0.01052～0.4208 μg。

2.6精密度试验 准确吸取供试品溶20 μl，连续进6次，测定绿原酸和金丝桃苷的峰面积，计算相对标准偏差分别为0.24%和0.99%，结果表明仪器精密度良好。

2.7稳定性试验 取同一批次(20101025)当归地上部分药材粉末约1.0 g，精密称定，按“2.3”项下操作，在上述色谱条件下，分别于0、2、4、6、8、12 h测定，测得绿原酸和金丝桃苷色谱峰面积，计算相对标准偏差分别为1.44%和1.20%，结果表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.8重复性试验 取同一批次(20101025)当归地上部分药材粉末6份，精密称定，按“2.3”项下操作，在上述色谱条件下进样测定，测得绿原酸和金丝桃苷色谱含量，计算相对标准偏差分别为3.38%和0.16%。

2.9加样回收试验 取已知含量的当归地上部分药材(20101025)粉末6份，约0.5 g，精密称定，分别按已知含量100%加入绿原酸和金丝桃苷对照品，按“2.3”项下操作，在上述色谱条件下进样测定，平均加样回收率分别为97.34% (RSD=4.77%)，101.70% (RSD=3.07%)。

2.10样品测定 分别取不同批次当归地上部分药材粉末约1.0 g，精密称定，按“2.3”项下操作，制成供试品溶液，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20 μl，注入高效液相色谱仪，测定，结果见表1，色谱图见图1。

表1 当归地上部分中绿原酸和金丝桃苷的含量测定结果(n=3)

图1 高效液相色谱图

A 对照品；B 当归地上部分药材；1 绿原酸；2 金丝桃苷

3 讨论

当归为一种药食两用的常用中药材，但在传统用药习惯中当归仅仅以根为入药部位，每年当归采收后都有大量的地上部分废弃，不但造成极大浪费，还会污染环境。通过对当归地上部分有效成分的研究发现其中含有很多具有显著活性的化学成分，特别是所含有的绿原酸和金丝桃苷是重要的抗凝血及抗菌活性成分[4]。本文首次对当归地上部分中的绿原酸和金丝桃苷含量测定进行了研究，为当归地上部分的开发利用提供参考。提取条件的优化通过对提取溶剂，提取方法及提取时间的考察，确定50 ml 70%甲醇，超声45 min，可以完全提取1.0 g当归地上部分药材中的绿原酸和金丝桃苷。

[1] 南京新医学院. 中药大辞典. 上海: 上海科学技术出版社, 2006, 1207.

[2] Zhao KJ, Dong TX, Tu PF, et al. Molecular genetic and chemical assessment of radix Angelica (Danggui) in china. J Agric Food Chem, 2003, 51(9): 2576-2583.

[3] Deng SX, Chen SN, Yao P, et al. Serotonergic activity-guided phytochemical investigation of the roots of Angelica sinensis. J Nat Prod, 2006, 69(4): 536-541.

[4] Zhou GS, Yang NY, Tang YP, et al. Chemical constituents from the aerial parts of Angelica sinensis and their bioactivities. Chin J Nat Med, 2012, 10(4): 295-298.

DeterminationofchlorogenicacidandhyperosideintheaerialpartofangelicasinensisbyHPLC

HUShu-yi,LIUDong-lai.

LiMinPharmaceuticalFactoryofLIVZONPharmaceuticalGroup,Shaoguan,Guangdong512028,China

ObjectiveTo establish a HPLC method for the determination of chlorogenic acid and hyperoside in the aerial part of angelica sinensis.MethodsThe chromatographic separation was achieved on a GRACE C18 (250 mm×4.6 mm, 5 μm) column at a variable wavelength from 325 nm (Chlorogenic acid) to 355 nm (hyperoside) using a gradient mobile phase consisted of a mixture of acetonitrile (A) and 0.5% formic acid (B) at a flow rate of 1.0 ml/min.ResultsLinearity relationships of chlorogenic acid and hyperoside were 0.29～ 5.8 μg/μl (R2=0.9996), 0.1 ～ 2.0 μg/μl (R2=0.9999), respectively; the average recoveries were 97.34% (RSD=4.77%)，101.70% (RSD=3.07%).ConclusionThe results showed that the method is accurate, simple, repeatable and it is suitable for the quality control of the aerial parts of Angelica sinensis.

Angelica sinensis;Chlorogenic acid;Hyperoside;Content determination

512028 广东省丽珠集团利民制药厂