中草药对锦鲤抗水霉菌感染免疫功能的影响

黄 文，盛竹梅

（北京市水产技术推广站，北京 100021）

锦鲤Cryprinus carpiod是一种既可供观赏又可食用的名贵鱼类，但在生产实践中，时有养殖户因水霉病爆发而蒙受损失。水霉菌大量繁殖并附着在鱼体体表时，病鱼烦躁不安、食欲减退，最终因体质衰竭而死[1]。水霉病能在受伤鱼体之间相互传染，且死亡率相对较高[2]。以往的防治药物主要为孔雀石绿(MalachiteGreen oxalate)，因具有潜在致癌和高残留等副作用，于2002年被禁用，目前尚没有找到既安全又理想的替代药物，对于水霉病的治疗目前处于摸索和探索阶段[3]。近年来，中草药因其毒副作用小和低残留等优点，逐渐成为防治鱼病的首选和开发利用的热点研究对象。中草药作为生长促进剂、免疫调节剂，尤其是以苦参 Radix Sophorae flavescentis、黄芩 Scutellaria baicalensis、麻黄 Ephedra sinica、五倍子 Rhus chinensis为代表的单味中草药在养殖业中得到广泛应用[4-11]。鉴于这些中药的抗菌作用，实验将黄芩、麻黄、苦参、五倍子等六味中草药配伍制成复方中草药制剂使用，探讨它们对水霉菌感染的锦鲤免疫功能的影响及其对水霉病的防治效果，这无论从基础理论或应用前景来看，都具有重要意义。

1 材料和方法

1.1 试验鱼

试验用锦鲤购自北京市通州区鑫淼渔场，体重75±5 g。实验前暂养15 d，无死亡出现。

1.2 复方中草药制剂

复方中草药制剂自制[12]。

1.3 实验设计

实验设对照组、感染组和4个泼洒实验组，共6组，每组设1个重复。每实验箱体加曝气水180 L，放入健康的锦鲤10尾，总计120尾。感染组和治疗组采用0.3×107cfu/mL浓度的水霉菌进行感染，症状出现后正式开始试验。各组的药物质量浓度依次为0、0、2（实验Ⅰ）、4（实验Ⅱ）、16（实验Ⅲ）和 96（实验Ⅳ）mg/L。每6 d换水换药一次，保持药物质量浓度稳定。试验期间水温20±0.5℃。用气泵充气，每天进行箱底虹吸2次，清除残饵、粪便。每天上午09：00和15：00投喂饵料，日投饵率2.8%。

30 d后每组随机选取10条鱼尾静脉取血，用枸橼酸钠抗凝，在4℃条件下3 000 r/min离心10 min，分离血细胞和血浆，进行非特异性免疫因子测定。

1.4 实验方法

1.4.1 红细胞免疫粘附能力测定

1.4.1.1 血液样品处理

将上面离心所得的下层红细胞（RBC）用生理盐水洗涤三次后配成1.25×107cfu/mL悬液备用。

1.4.1.2 酵母菌的制备

将安琪公司生产食用活酵母用生理盐水溶解，高温灭活、定性滤纸过滤后分成2份。一份加入生理盐水洗涤1次制成未致敏酵母；另一份加入等量小鼠血清（北京莱博生物实验材料研究所），37℃水浴致敏30 min，离心洗涤一次为致敏酵母，两组计数后均配成1×108cfu/mL悬液备用。

1.4.1.3 锦鲤红细胞免疫粘附能力测定

依照郭峰[13]的方法，按公式算出C3b受体花环形成率（C3bRR）和免疫复合物花环形成率（ICRR）。

1.4.2 血浆补体C3和C4含量测定

采用试剂盒测定（伊利康生物技术有限公司生产），分别按要求加入试剂及血清后，在37℃水浴10 min，用Eos Bravo forte的REF LICG 899生化分析仪，在340 nm波长处读取测定管和标准管的吸光度(A)，按下面公式计算补体C3、C4的含量。

式中：△AT以空白管吸光度作对照的样品管吸光度值

△As以空白管吸光度作对照的校准管吸光度值

Cs校准液中C3的浓度。

补体C4按同样的公式计算。

1．5 统计学分析

实验数据经SPSS 12．0软件分析，空白对照组与感染组间应用“两独立样本的T检验”分析，感染组与实验药物泼洒组之间采用单因素方差分析，组间差异采用LSD（Least Significant Difference Procedure）多重比较分析。差异显著性均以P＜0．05为标准，各结果均以平均值±标准误来表示。

2 结果

2．1 复方中草药制剂泼洒对锦鲤红细胞C3bRR和ICRR的影响

T 检验表明，锦鲤感染水霉菌后，其红细胞 C3bRR 有明显变化（t=2．274，P＜0．05），水霉菌组 C3bRR 明显低于对照组。单因素方差分析表明，复方中草药制剂对锦鲤红细胞C3bRR没有明显影响（F（4，41）=1．01，P=0．413），各实验组与感染组之间没有显著差异（P＞0．05）（表 1）。

锦鲤感染水霉菌后，其红细胞ICRR有明显变化（t=－3．041，P＜0．05），水霉菌感染组，其红细胞ICRR 明显高于对照组。单因素方差分析表明，复方中草药制剂泼洒后，锦鲤红细胞ICRR有显著影响（F（4，39）=2．725，P=0．043），在 2 mg/L 和 96 mg/L 质量浓度时，其 ICRR 明显低于感染组（P＜0．05）。

表1 复方中草药制剂对锦鲤红细胞C3bRR和ICRR的影响（均值±标准误）Tab．1 Compound Chinese herbal medicine on koi erythrocyte C3b receptor rosette rate and circulating immune complex rosette rate of(mean±standard error)

2．2 复方中草药制剂对锦鲤血浆补体C3和C4含量的影响

T检验表明，水霉菌感染对锦鲤血浆补体C3和C4含量均没有明显影响（其t值和P值分别t=0．080，P=0．937；t=0．488，P=0．632），对照组和感染组间没有差异（P＞0．05）（表 2）。

单因素方差分析表明，复方中草药制剂泼洒后对锦鲤血浆补体C3和C4含量均没有显著影响（其F值和 P 值分别为：F=1．598，P=0．192；F=1．250，P=0．304），各实验组与感染组之间没有显著差异（P＞0．05）。但表2可以看出，质量浓度在2～16 mg/L范围内，随着复方中草药制剂泼洒质量浓度的升高，血浆补体C3和C4含量有升高的趋势，并在泼洒质量浓度为16 mg/L时最高，而在泼洒质量浓度为96 mg/L时，二者与泼洒16 mg/L质量浓度相比反而出现了降低的趋势。

表2 复方中草药制剂对锦鲤血浆补体C3和C4含量的影响（均值±标准误）Tab．2 Compound Chinese herbal medicine on koi plasma complement C3 and C4 level(mean ± standard error)

3 讨论

3．1 复方中草药制剂对水霉菌感染锦鲤红细胞免疫粘附能力的影响

红细胞的免疫功能受多种因素影响，不同鱼类的红细胞C3bRR在种间、杂交种与其亲本之间以及种内不同群体间都存在差异[13]。该研究表明，水霉菌感染能使锦鲤红细胞C3bRR减少而ICRR增多与环境激素硫丹能导致小鼠红细胞C3bRR降低而ICRR升高[14]一致；而复方中草药制剂泼洒后，锦鲤红细胞C3bRR与感染组之间均没有明显差异，但泼洒2 mg/L和96 mg/L浓度组的红细胞ICRR，明显低于感染组。这说明水霉菌能明显影响锦鲤红细胞免疫粘附能力，复方中草药制剂泼洒后对其ICRR影响显著，而对其C3bRR没有明显影响。这与刘红柏等[15]黄芪能提高红细胞C3b受体花环率，而对红细胞免疫复合物的百分率影响不明显结果相一致。水霉菌对锦鲤红细胞免疫粘附功能的影响，可能是由于水霉菌的感染促使大量C3b占据红细胞膜上的CR1受体，被占据的受体不能再与致敏酵母结合，导致了C3bRR的下降；而CR1上结合的C3b却能直接粘附未致敏酵母，从而导致ICRR上升，使红细胞不能有效发挥清除免疫复合物的功能，红细胞免疫功能出现继发性降低。而复方中草药制剂的泼洒，可能在一定程度上改变了结合在CR1上的C3b粘附未致敏酵母的能力，从而影响了ICRR，它可能在一定浓度范围内能促进ICRR升高，但过高的浓度，反而会抑制ICRR。

3．2 复方中草药制剂对水霉菌感染锦鲤血浆补体C3和C4含量的影响

补体是存在于人和动物血清中的一组不耐热的具有酶活性的糖蛋白，其中C4参与补体经典途径的激活过程，而C3在补体激活的经典途径和替代途径中都起作用[16－17]。该研究结果显示，锦鲤血浆补体C3和C4含量在水霉菌感染前后没有明显变化。这说明，水霉菌感染对锦鲤血浆C3和C4合成没有显著影响。这可能是由于水霉菌的感染，启动了锦鲤更敏感的防御体系进行自卫，没有启动补体C3和C4的合成体系所致。机体不同的免疫指标可能对病原菌的敏感程度不同，从该实验结果可以看出，红细胞免疫粘附功能对水霉菌的敏感程度要比补体C3和C4高。

王庆奎等[18]认为喂食当归多糖能提高血浆补体C3含量，但补体C4含量与当归多糖添加量无相关性。该实验中，4个不同质量浓度复方中草药制剂泼洒后，锦鲤血浆补体C3和C4含量与感染组之间也没有显著差异，这与苏岭等[19]发现，未注射细菌性抗原时中药复方能提高C3、C4含量；注射细菌性抗原后，仅C4含量升高的结果不同。但质量浓度在2～16 mg/L范围内，随着泼洒复方中草药制剂质量浓度的升高，血浆补体C3和C4含量有升高的趋势，说明复方中草药制剂对水霉菌有一定的抑菌作用，而在泼洒浓度为96 mg/L组，其补体C3和C4含量与16 mg/L浓度组相比反而出现降低趋势。这与周显青[20]认为维生素C在一定剂量范围内，能提高中华鳖Trionyx Sinensis血清补体C3和C4的水平相一致。这说明，复方中草药泼洒对血浆C3和C4含量的影响可能存在一个适宜的浓度，只有在适宜浓度范围内，才可能刺激补体分泌细胞产生补体C3和C4，超过这个范围可能反而有抑制作用，从该实验的结果推测，复方中草药制剂泼洒很可能在泼洒质量浓度为16～96 mg/L之间有一个浓度能促进其产生，只是由于这两个泼洒浓度之间跨度太大，在该实验没有出现而已。

综上所述，泼洒复方中草药制剂在2～16 mg/L范围内，复方中草药制剂泼洒后对其ICRR影响显著，而对其C3bRR没有明显影响；血浆补体C3和C4含量有升高的趋势，在一定程度上能提高锦鲤抗水霉菌感染的免疫能力。

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