标准化临床样本库的创建与管理

杨静芳， 陈 凌， 张新胜， 卞琳琳， 吉训明

(首都医科大学宣武医院，北京市老年病医疗研究中心科研处，北京 100053)

0 引言

标准化、高质量的样本库是重大疾病基础与临床研究、临床诊治技术研发、药物研发、健康研究与产业化，即实现转化医学的最宝贵资源。随着生物医药研究的飞速发展，临床样本资源的重要性已经得到广泛的重视和充分的认识。临床样本是不可再生的宝贵资源，高质量的临床研究样本对探索新的治疗方法、发现新的诊断工具、制定新的诊断指标以及新药的研发都凸显出极其重要的意义。医学临床样本的收集管理和利用日益引起发达国家医学研究工作者的重视，国外早已建立了标准化的样本库且信息化管理机制不断完善。目前，国际知名的样本库有联合了几大欧洲重点生物库的泛欧洲生物样本库与分子生物资源研究中心(BBMRIhttp://www.bbmri.eu)，英国生物样本库(UK Biobank，http://www.ukbiobank.ac.uk)及法国国家健康与医学研究院 (INSERM，http://www.english.inserm.fr)等。

中国有庞大的临床样本资源，且有能力将其妥善处理并加以保存。建设高质量、高标准的样本库将给我国的生物医药产业、生命科学的基础研究和临床研究提供强有力的支撑[1]。然而，目前我国综合医院临床样本库建设尚处于初创阶段，由于缺乏足够的交流与沟通，不同的样本库在建设过程中没有统一的标准，在管理和质量水平上存在角度的差别，同国外的样本库也存在着一定的差距[2]。近期，通过实地调研及国际交流等方式，就综合医院临床样本库的建立与管理做了一些相应的考察、研究和分析。

1 资料与方法

(1)文献复习。通过清华同方中国期刊全文数据库(CNKI)、中国科技论文统计数据库(CSTP)及万方数据库，以“样本库”为关键词，检索2006～2011年相关中文文献。共获得文献81篇，选取其中与医学卫生或生物科学相关且有代表性的22篇文献进行学习，对样本库的建设和管理有了理论认识。

(2)实地调研。2011年6月赴上海对第二军医大学东方肝胆外科医院国家肝癌样本库[3-4]进行实地调研，并与样本库管理人员、工作人员及样本管理系统的软件开发人员(上海生物信息技术研究中心)进行面对面交流，学习建库的成功经验。该样本库启动于2008年，依托于国家科技重大专项课题建立了专业性的肝癌样本库，利用双重条形码技术结合样本信息化管理系统实现了临床组织样本库的标准化管理[5-7]，是临床组织样本库标准化建设试点单位之一。

(3)国际交流。2010年10月参加2010第二届中国组织生物样本库的标准化建设与应用研讨会，于2011年7月参加国际标准化生物样本库的管理与质控会议暨2011年上海生物样本库建设研讨会，于2012年6月参加第四届中国生物样本库标准化建立与应用研讨会，于2013年3月参加《ISBER最佳实践2012》培训，于2013年4月参加《生物样本库质量管理实战培训》[8-11]。目前，有关生物样本库的国际交流平台主要集中在上海，历次会议汇集了泛欧洲生物样本库与分子生物资源研究中心(BBMRI)、英国生物样本库(UK Biobank)、法国国家健康与医学研究院(INSERM)等国际著名的生物样本库建设主体单位负责人及国内知名样本库的负责人。会议期间，通过与国内外专家学者进行面对面的交流讨论，深刻领悟了样本库建设的重大意义及标准化管理的迫切性。

(4)政策法规及行业标准学习。通过互联网检索国际及国内有关遗传资源及样本库建设方面的政策法规、行业标准、技术规范、标准操作规程(SOP)等文件。学习并了解了国际上的行业标准一般遵循ISO 9001认证或OECD(Organization for Economic Co-operation and Development)指南。而我国目前没有统一的行业标准，对样本库的资质也没有统一的国家认证。我国临床样本库的现状是，依托于研究项目或课题的资金资助，建立适用于各自项目的技术规范和标准体系。所谓“标准化”实际上很难统一，短时间内很难建立国家的行业标准。由于人类遗传资源的特殊性质，涉及伦理学问题，因此，国际上遵循HUGO伦理委员会章程，而我国于1998年出台的《人类遗传资源管理暂行办法》(国办发[1998]36号)则为遗传资源的保护、开发利用及伦理学方面提供了法律依据。

2 结果

2.1 临床样本库的建立

(1)基础设施与仪器设备。要求具有独立空间，设置专门的库房，面积根据样本库库存量而定，但基本的区域应该具备:标本出入库登记区、标本处理区、临床资源数据库区、冷冻区(划分－80℃超低温冰箱、－150℃液氮罐两个温度冷冻区)、标本分析区等(见图1)。另外，样本库必须具备专用电源及备用电源、空调及实时监控设施。

图1 样本库架构

(2)实施方案与技术路线。临床样本库建立的基本路线是收集、保存、利用，其基本原则是临床医生提出需求，针对某种疾病的样本进行有目的收集，而不是任何临床样本都要收集。① 临床医生一定要参与样本收集，与患者或家属签署知情同意书，并对临床信息进行采集，以保证标本的相关资料收集保存完整。②样本库的工作人员需具有责任心及相应的专业技术知识，样本收集的关键在于样本的质量，操作过程应避免外界污染以及标本之间的交叉污染，严格控制标本离体时间，从而确保标本的质量，样本的收集一定按照严格的标准操作规程(SOP，见图2)，每个岗位由专人负责，并进行岗前培训。③样本库建立目的是为了利用，只有充分利用样本库的资源达到物尽其用，才能避免“垃圾进，垃圾出”的后果。最后，样本库的成败在于规范化管理，只有按照一定标准进行收集、保存及利用，才能真正发挥样本库的作用，为临床研究服务。总之，临床样本库的建立和正常运行需要医院各部门(临床科室、手术室、病理科、设备科)协调配合，尤其需要医院领导的大力支持，并得到本单位伦理委员会的批准。

图2 样本采集标准操作规程

2.2 标本的质量控制

(1)组织标本的收集、处理及保存。取材部位必须准确，一定要由病理科医生进行取材，在肿瘤组织离体30 min内，在保证医院病理科留取足够用于诊断的组织标本后，按癌、癌旁(距离肿瘤组织2 cm的组织)和切缘远端非癌组织(正常组织)，分别切成数小块，根据应用范围做下述3种处理:①用于RNA提取的组织:将组织标本切成厚度小于0.5 cm的小块，投入到5倍体积的RNAlater试剂中，4℃浸泡过夜，第2 d从RNAlater中取出标本，放于冻存管中，－80℃保存。②用于DNA及蛋白提取的组织:切取小块标本不经处理，直接放入冻存管中，置于液氮处理30 min，再转入－80℃超低温冰箱保存。③用于石蜡包埋的组织:标本取材后立即置10%中性甲醛水溶液固定过夜，流水冲洗约3 h，然后放入自动脱水机脱水、透明、浸蜡，再用石蜡包埋，制成蜡块。所有的石蜡包埋组织均进一步切片，HE染色，鉴定组织形态。蜡块和切片分别归档保存，HE染色切片在显微镜下照相存于电脑数据库中。

(2)血液标本的收集、处理及保存。采集患者血液标本10 mL，抗凝血和非抗凝血各5 mL，做如下处理:①非抗凝血采集后室温静置2～3 h，以3 000 rpm离心5 min，吸出上层血清，分装到10支冻存管内，每管约200 μL，冻存于－80℃超低温冰箱。②抗凝血以3 000 r/min离心5 min，吸出上层血浆，分装到冻存管中，冻存于－80℃保存。③分离血浆后的下层血液，用生理盐水反复洗涤并离心分离白细胞后，用盐析法提取基因组DNA，分装冻存管中，－80℃保存。

(3)标本信息资料的记录。主要包括以下内容:病人的一般资料(姓名、性别、年龄、民族、职业、联系方式、住院号、病例摘要、临床诊断、病理诊断、实验室检查、其他检查等);标本资料(入库编号、入库时间、病变部位、标本描述、标本类型、标本数量、库存位置等);标本使用资料(出库编号、出库时间、出库数量、标本类型、实验内容、实验结果、使用人、使用日期、审批人等);标本废除资料(废除序号、废除原因、入库编号、标本原库存位置、废除日期、经手人等)。

(4)标本的定期随机抽样质控。对库存标本定期随机抽样进行总RNA提取鉴定，对RNA样品经紫外分光光度计分析，若得出A260/A280﹥1.6，1%琼脂糖凝胶电泳后，可见明显的28 s和18 s条带，而且28 s的亮度大约是18 s的1～2倍，表明RNA保存比较完整。

2.3 标本库的规范化管理

(1)数据库管理。在临床样本库中，有大量资料需要记录，包括患者信息、临床资料、病理资料、标本信息和随访信息等。建立一套组织科学合理、信息全面而专业化的标本库管理系统，对各类标本信息进行完善的组织和管理，是创建标本库的前提条件[12]。标本管理系统可以根据本单位情况自行开发设计，也可以请专业的软件开发公司个性化定制。目前，很多公司开发了针对大型临床样本库而设计的标本管理软件系统，系统运行平台一般基于Windows XP操作系统。考虑到数据库的安全及运行速度，最好配有独立的服务器，以保证数据库的高安全性和高容量。随着医学信息系统的日益普及和完善，作为物流跟踪过程中的关键技术“条形码技术”已在临床医学中得到应用。第二军医大学东方肝胆外科医院建立的国家肝癌样本库采用双重条形码定位技术，同一个样本具有两个条形码标签，一个是样本编码，另一个是定位编码，其编码规则一目了然，即使由于疏忽导致样本放错位置，也可以根据定位编码很容易找到其相应位置。目前，最新出现的二维码技术[13]解决了样本信息容量的问题，但是编码不直观，只能通过计算机扫描识别。另外，样本库信息管理系统需具备与医院HIS系统接口，以便提取患者的基本信息和检验、治疗、病理及随访等信息。

(2)标本库管理。建立统一的管理规范，明确工作环节中的规章制度，从入库到出库都必须有章可循。标本库的工作人员编制相对固定，需具备一定的技术水平和实验室管理能力，明确标本库工作人员职责，实现专人负责，加强对各岗位工作人员专业知识培训，并增强对标本库维护的责任感，保证标本从收集、保存到利用整个过程有条不紊进行。目前，中国医药生物技术协会组织生物样本库分会颁布了生物样本库标准[14]，规范了我国生物样本库的管理。

3 讨论

随着人类基因组计划的完成，为重大疾病诸如肿瘤、心血管疾病、代谢性疾病、老年病、精神疾病及遗传病等相关基因的功能研究提供了基本蓝图。利用人类基因组工作所取得的成果，研究和了解与生理和疾病相关的基因或遗传因素的前提就是要有疾病相关的遗传资源，包括遗传物质如DNA、病变组织及临床流行病学资料等。因此，遗传资源已成为21世纪重大疾病研究中最具有依赖性的因素。

目前，生命科学界清楚地认识到，世界范围内的遗传资源(生物样本库)网络的创立和协作将成为重建现代生物基因组和后基因组至关重要的一步。我国也将重大疾病遗传资源收集和保存、利用列入“十五”重大科技专项“人类重大疾病相关基因的研究”项目的子课题[15]。但是目前，这些重大疾病遗传资源的收集、保存和利用工作还存在许多问题:① 样本收集随机性且无代表性;②缺乏多学科研究人员的协作;③缺乏严格的程序规范及行业标准;④遗传资源的利用率低下;⑤伦理学立法有待完善。

4 结语

生物样本库已经成为生物医学研究和药品研发领域新的必备基础和来源，它所承载的历史使命极具挑战性。①建立和维护一个大型的生物样本库，不仅仅是一项简单的收集工作，而是要通过样本库将现有的宝贵的遗传资源转化成基因学研究的新工具，从而赋予其特定的知识价值，促进医学科学发展。②样本库既不可能快速建立，也不容易维护，更是难以在短时间内成为现代生物医药研发中的一个完整有效的组成部分。样本库涉及各种复杂和交叉的知识体系网络，其发展取决于众多因素。最后，样本库创造价值的能力，取决于管理体系的建立和有序模式的建立。为了是一个样本库能够正常运转，必须要建立一系列样本研究的科学有效性的质量管理机制。

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