人体膝关节交叉韧带生物材料力学特征实验研究

沙川华，张 涛，李 龙

膝关节在人体直立、行走、跳跃中起着十分重要的作用，结构上需要稳定性好，灵活性强。保障膝关节稳定性的韧带关节囊网属于内源性稳定装置［7］，主要由关节囊、关节的各类韧带构成。膝关节交叉韧带属于韧带关节囊网中重要组成部分，起着连接股骨下端与胫骨上端的作用，具有限制胫骨前、后移动的功能，在膝关节完成屈伸、旋转运动中常常处于被动牵拉状态，容易发生损伤，并可能引起关节内相关结构的损伤，导致关节稳定性下降，从而加速整个关节的病变［10］。进行膝关节交叉韧带生物材料力学实验研究，目的是探讨其损伤的机理，为韧带损伤的修复、置换等提供材料力学参数与理论依据。

1 实验材料与试件制备

1.1 韧带提取

从6具成年男性（年龄25～35岁）新鲜尸体上截取12个正常无病变膝关节，解剖得到左、右前交叉韧带与后交叉韧带各6条，共计24条（图1）。用格林氏液洗去表面滑液，修洁韧带周围软组织后，根据前交叉韧带分为较窄的前内束与较宽的后外束、后交叉韧带分为较宽的前外束与较窄的后内束的观点［2］，在ACL与PCL上定点、划线（图2、图3），沿划线在医用显微镜（4×5倍）观察下用解剖刀将 ACL分为 AMB与 PLB，PCL分为 ALB与 PMB①②人体膝关节交叉韧带包括前交叉韧带与后交叉韧带，前交叉韧带英文缩写为“ACL”，后交叉韧带英文缩写为“PCL”。ACL的前内束英文缩写为“AMB”，ACL的后外束英文缩写为“PLB”；PCL的前外束英文缩写为“ALB”，PCL后内束英文缩写为“PMB”。［3］。

图1 ACL与PCL实物图Fighue 1.ACL and PCL

1.2 试件制备

使用四川大学华西口腔医学院病理实验室德国莱卡恒冷切片机（型号CM3050S，图4），制备标准试件，每张切片厚200μm，长25mm，宽10mm③根据文献研究得知，ALB、PMB、AMB、PLB中的胶原纤维主要呈与韧带长轴平行的状态，故本实验制作冰冻切片时，采用顺着韧带纤维走向进行。。挑选切片完整的AMB、PLB、ALB、PMB切片各20张，共计80张，应力松弛试验与一维拉伸试验各用40张（图5）。试件制备后，按侧别、部位分别装入浓度为3%中性福尔马林溶液的丝口瓶中，密封置于4℃冰箱内待用，试验在3天内完成。

图2 ACL分部示意图Figure 2.Segment Schematic Diagram of ACL

图3 PCL分部示意图Figure 3.Segment Schematic Diagram of PCL

图4 德国徕卡冰冻切片机（型号CM3050S）实物图Figure 4.German Leica Frozen Slicer（Model CM3050S）

图5 冰冻切片试件实物图Figure 5.Frozen Section Specimens

图6 微观力学测试仪实物图Figure 6.Micromechanics Tester

2 实验仪器与方法

2.1 实验仪器

两项试验与数据采集均在上海大学力学实验中心“生物材料力学性能测试系统”完成，该系统计算机采样速度为10次／s，并同步记录载荷-位移曲线（图6、图7）。整个实验操作在室温下（25℃左右）进行，随时用3%中性福尔马林溶液保持试件湿润。

图7 计算机记录“载荷-位移曲线”示意图Figure 7.Computer Recorded Load-Displacement Curve

2.2 实验方法

2.2.1 预调

将试件固定于测试仪器上，用游标卡尺测量其初始长度，以1min应变约为试件初始长度10%的速度将其拉伸至4%应变长度，同速卸载休息10min，重复3次。

2.2.2 应力松弛试验

将预调后的试件在0～3s内分别产生2%、4%、6%、8%的阶跃应变，然后保持应变150s，同步记录载荷-时间关系曲线，计算分析ACL与PCL不同部分的应力-时间特征、弹性响应特征，反映其对载荷的力学反应。

2.2.3 一维拉伸试验

将预调后的试件以10mm／min的应变速度将其拉伸至破坏，记录载荷-位移关系曲线后，转化为应力-应变关系曲线，反映ACL与PCL不同部分抗拉伸的能力。

3 理论分析与数据处理

3.1 理论分析

生物材料的应力σ＝P／Ao，其中，P为加在试件上的载荷，Ao为试件原始截面积；应变ε＝ΔL／L，ΔL为试件伸长值，L为原长。转换各组的载荷-时间曲线为应力-时间关系，载荷-位移曲线为应力-应变关系。根据Fung YC拟线性粘弹性理论，生物软组织在一维拉伸时的应力变化历程表达为 :

式中:G（t）是归一化松弛函数；σe（ε）是组织的弹性响应。由于试验中加载速度是常数，若令其为a，则ε＝at，＝a，根据实验结果，可选择:

代（2）、（3）入（1）并令t-τ＝u

拉伸刚度“K”是指试件抵抗变形的能力，即引起该试件变形时所需要的力，以试件在某个变形状态下对应的载荷作为其拉伸刚度。

弹性模量“E”是指试件在外力作用下产生单位弹性应变所需应力，用以衡量试件产生弹性变形难易程度，值越大，使其发生弹性变形的应力也越大［6］。

3.2 数据处理

采用SPSS 17.0统计软件处理实验数据［5］，计算数据的“”，并进行左、右ACL与PCL相同部分之间比较，ACL不同部分之间比较，PCL不同部分之间比较，同侧ACL与PCL不同部分之间比较。不同组间差异显著性检验采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用“sidak”和“tamhane’s T2”法比较，结果 P＜0.05为显著性差异，P＜0.01为非常显著性差异。

4 实验结果与讨论

4.1 左、右膝关节ACL与PCL比较

比较结果表明，人类膝关节ACL与PCL相同部分之间均没有明显的侧别差异（P＞0.05），分析原因主要有两点:第一，由于胚胎发育时双侧膝关节韧带组织结构来源相同，均由髁间的隔障发生形成［11］，其组织结构均主要由胶原纤维为主的致密结缔组织构成［1，12］，故其力学性能应基本相同；第二，人类在直立行走、支撑站立、各类运动中，双侧下肢受力均等，负荷差异不大，需要的稳定性条件也基本相同，故保障膝关节稳定的韧带装置的生物力学特征也就不会有明显的侧别差异。

4.2 ACL与PCL各部分比较

为了解ACL与PCL各部分生物材料力学特征，将2项实验的数据进行了如下处理:

1）AMB与PLB比较；2）ALB与PMB比较；3）AMB与ALB比较；4）PLB与PMB比较；5）ALB与PLB比较；6）AMB与PMB比较。

4.2.1 应力松弛试验

4.2.1.1 “应力-时间”特征

试验中分别记录ACL与PCL各部分在第1s和第100s时刻的受力大小，计算各部分的应力松弛率①1s应力松弛率＝（原始力-1s力）／原始力，100s应力松弛率＝（原始力-100s力）／原始力。原始力为电脑同步记录的最大载荷；1s力为电脑同步记录的最大载荷相应时间后1s的载荷；100s力为电脑同步记录的最大载荷相应时间后100s的载荷。，并对其进行显著性差异检验。经方差分析，F检验，确定用“sidak”方法进行成对比较，t检验，结果为:1）PMB1s应力松弛率最大，其次为PLB、ALB，AMB最小。PMB高度显著性大于其他3部分（P＜0.01）；PLB高度显著性大于 AMB与 ALB（P＜0.01），高度显著性小于 PMB（P＜0.01）；ALB高度显著性大于 AMB（P＜0.01），高度显著性小于PMB（P＜0.01）；AMB呈高度显著性小于其他3部分（P＜0.01）；2）PMB100s应力松弛率最大，其次为PLB、AMB，ALB。PMB高度显著性大于其他3部分（P＜0.01）；AMB与PMB、ALB之间有高度显著性差异（P＜0.01）；PLB与 PMB、ALB之间有高度显著性差异（P＜0.01）；PLB高度显著性大于 AMB与 ALB（P＜0.01），高度显著性小于PMB（P＜0.01）；ALB高度显著性小于其他3部分（P＜0.01），高度显著性小于 PMB（P＜0.01）；AMB高度显著性小于PLB与PMB（P＜0.01），高度显著性大于 ALB（P＜0.01（表1）。

表1 ACL与PCL各部分1s、100s应力松弛率比较一览表Table 1 Comparison of 1sand 100sStress Relaxation Rate for Various Parts of ACL and PCL（，%）

表1 ACL与PCL各部分1s、100s应力松弛率比较一览表Table 1 Comparison of 1sand 100sStress Relaxation Rate for Various Parts of ACL and PCL（，%）

注:AMB与PLB、ALB、PMB之间比较:＃＃表示P＜0.01；PLB与AMB、ALB、PMB之间比较:◆◆表示P＜0.01；ALB与 AMB、PLB、PMB之间比较:●●表示P＜0.01；PMB与 AMB、PLB、ALB之间比较:◇◇表示P＜0.01。

名称1s 100s AMB 4.65±1.98●●◇◇ 33.99±12.90●●◇◇PLB 14.85±13.04●●◇◇ 40.40±15.36●●◇◇ALB 9.52±8.22＃＃◆◆ 32.46±13.66＃＃◆◆PMB 15.56±10.96＃＃◆◆ 51.09±19..60＃＃◆◆

生物材料的应力松弛率与其粘性大小成正相关关系，松弛率越大，表明粘性越大，在承受较大负荷的持续作用时，将具有较好调整负荷的能力，从而减少对施加其上产生的长期应力，达到保护生物材料自身的需要［12］。从实验结果比较得知，PLB与PMB在1s和100s时刻的应力松弛率均明显大于AMB与ALB，表明PLB与PMB无论是瞬时粘性，还是被拉长后的粘性均强于AMB与ALB。此实验结果提示:PLB与PMB无论在膝关节运动瞬间，还是在较长时间持续运动中，均具有较好的自我调整能力，能够承受关节运动对其产生的较大牵拉、扭转等负荷，适应较长时间工作的应力需要。有研究表明，在伸膝关节的最后20°时往往还伴有内旋运动［3］。笔者认为，PLB与PMB粘性较强，是其能够承受这种独特运动形式的材料学原因之一②本课题主要从生物材料力学的角度对交叉韧带不同部分进行实验研究，对其组织结构、力学构造等方面与材料学实验结果的关系等方面的研究有待今后进一步深入。。此外，从膝关节韧带损伤的临床表现看，PLB与PMB相对来说也比AMB与ALB发生率低［8］，可能也是因为后者的粘性较差，其材料应变的适应能力相对不足的缘故。

4.2.1.2 弹性响应特征

试验中分别记录ACL与PCL各部分处于2%、4%、6%、8%的阶跃应变，保持应变150s，同步记录载荷-时间关系曲线。在同一阶跃应变下，ACL与PCL 各部分瞬时弹性响应均呈现非线性关系。计算ACL与PCL不同部分若干试件处于2%、4%、6%、8%的阶跃应变的，经方差分析，F检验，确定用“tamhane’s T2”法，进行成对比较，t检验。结果为:1）在拉伸至2%时，瞬时弹性响应ALB明显大于 AMB、PLB（P＜0.05）；2）在拉伸至4%时，瞬时弹性响应ALB明显大于AMB（P＜0.05），ALB高度明显大于PLB（P＜0.01）；3）在拉伸至6%和8%时，瞬时弹性响应ALB均明显大于 AMB（P＜0.05），ALB均明显大于PLB（P＜0.05，表2）。

表2 ACL与PCL各部分瞬时弹性响应比较一览表Table 2 Comparison of Instantaneous Elastic Response for Various Parts of ACL and PCL （，MPa）

表2 ACL与PCL各部分瞬时弹性响应比较一览表Table 2 Comparison of Instantaneous Elastic Response for Various Parts of ACL and PCL （，MPa）

注:AMB与PLB、ALB、PMB之间比较:＃表示P＜0.05；PLB与AMB、ALB、PMB之间比较:◆表示P＜0.05，◆◆表示P＜0.01；ALB与AMB、PLB、PMB之间比较，●表示 P＜0.05；●●表示P＜0.01；PMB与 AMB、PLB、ALB之间比较，◇表示P＜0.05。

应 变2% 4% 6% 8%AMB 0.0641±0.0602● 0.1900±0.1408● 0.3467±0.2540● 0.4759±0.3662●PLB 0.0495±0.0385● 0.1644±0.1195●● 0.3422±0.2598● 0.5394±0.4242●ALB 0.2753±0.2763◇◆ 0.4939±0.3628◇◆◆ 0.7105±0.4582◇◆ 0.9424±0.5784◇◆PMB 0.1803±0.3095 0.5585±0.9715 0.9899±1.7238 1.4445±1.0038

“瞬时弹性响应”是指生物材料在外力作用下产生拉伸变形时瞬间产生的应力。数据比较显示，AMB在2%时的瞬时弹性响应明显大于PLB，说明前者在拉伸的初始阶段对使其变形所施加的力反应较强；ALB在4%时的瞬时弹性响应明显大于AMB与PLB，ALB在6%和8%时的瞬时弹性响应均明显大于AMB，说明ALB即使随着材料的被拉伸长度的增加，仍然会保持对使其变形所施加的力呈现较强的应力特征。RaceA等研究表明，ALB的横截面积是PMB的2倍，其坚韧性和强度是PMB的1.5倍［14］，是否就是ALB瞬时弹性响应较大的原因，有待进一步研究确定。

4.2.1.3 归一化应力松弛函数

归一化应力松弛函数的表达公式为“G（t）＝Clnt＋D”［9］，根据实验数据拟合出 AMB、PLB、ALB、PMB的常数C、D，代入公式，得到其归一化应力松弛函数（表3）。

表3 ACL与PCL各部分归一化应力松弛函数一览表Table 3 Normalized Stress Relaxation Function for Various Parts of ACL and PCL

4.3 一维拉伸试验

通过一维拉伸破坏试验的数据绘出ACL与PCL各部分应力-应变关系曲线图，由此图得到AMB、PLB、ALB、PMB的拉伸刚度、弹性模量、破坏应力、破坏应变等力学参数①拉伸刚度与弹性模量的确定:交叉韧带各部分均为粘弹性组织，从本实验数据绘出的拉伸图形表明，ACL与PCL不同部分在变形为10%时，均呈现出较好的线性状态，故确定此时刻的载荷为“拉伸刚度”，而以此时刻的应力均数除以应变得到的数值为“弹性模量”。，了解其抗拉伸能力。此外，通过该实验的数据还能够计算得到AMB、PLB、ALB、PMB的常数，并推导本构方程。

4.3.1 应力-应变关系

通过实验数据绘出的 AMB、PLB、ALB、PMB“应力-应变关系”曲线均表现出共同的特征:应力随着应变增大达到一定值后，又逐渐减小。拉伸应力在5%应变段内改变较小，在6%～12%应变段，拉伸应力随应变增大而增大，达到12%后，应力随着应变的增长，呈现逐渐减小的现象（图8～图11）。

图8 AMB“应力-应变”关系曲线图Figure 8.AMB"Stress-Strain"Curve

图9 PLB“应力-应变”关系曲线图Figure 9 PLB"Stress-Strain Relationship

图10 ALB“应力-应变”关系曲线图Figure 10.ALB"Stress-Strain"Curve

图11 PMB“应力-应变”关系曲线图Figure 11.PMB Stress-Strain Curve

ACL与PCL与人体其他关节的韧带一样，主要为胶原纤维，这类纤维在受力初期均会表现出各部分的胶原纤维排列成波浪状，胶原与蛋白多糖基质和间隙液相互作用，共同承受应力应变而不易引起组织损伤。然而，随着应变增加，部分屈曲较小的胶原纤维在受力早期即被拉直，随应变的增加出现了较大的应力松弛甚至局部破坏，拉伸刚度迅速减小，较小的应力增加也能产生很大的应变增量，组织开始变形甚至破坏［4］。故为了防止膝关节的ACL与PCL各部分出现损伤，在下肢完成各种运动，或者承重时，一定要注意运动强度、运动持续时间等要素的把握，尽量避免长时间的持续受力，也应注意加强膝关节周围肌力的训练，增强其对保持关节稳定性效果，达到保护关节韧带的作用。

4.3.2 抗拉伸能力

拉伸刚度、弹性模量、破坏应力和破坏应变均能够反映生物组织承受拉伸负荷的能力。通过实验数据计算，确定 AMB、PLB、ALB、PMB的4项指标（表4）。经方差分析、F检验，结果有2点:1）ACL与PCL各部分的拉伸刚度、弹性模量、破坏应力均没有显著性差异（P＞0.05）；2）PLB与PMB的破坏应变明显大于AMB与ALB（P＜0.05）。

表4 ACL与PCL不同部分抗拉伸能力参数一览表Table 4 Anti－tensile Capacity Parameters for Different Parts of ACL and PCL （）

表4 ACL与PCL不同部分抗拉伸能力参数一览表Table 4 Anti－tensile Capacity Parameters for Different Parts of ACL and PCL （）

注:AMB与PLB、ALB、PMB之间比较:＃表示P＜0.05；PLB与 AMB、ALB、PMB之间比较:◆表示P＜0.05；ALB与AMB、PLB、PMB之间比较:●表示P＜0.05；PMB与AMB、PLB、ALB之间比较:◇表示P＜0.05。

拉伸刚度（N） 弹性模量（Mpa） 破坏应力（Mpa） 破坏应变（%）AMB 0.3786±0.2304 5.3744±4.2092 0.7416±0.4807 13.47±4.79◆◇PLB 0.6422±0.4305 7.5879±5.3867 1.2504±0.9950 19.81±8.32＃●ALB 0.6553±0.4661 10.8190±8.2478 1.2518±0.7752 12.82±3.61◆◇PMB 0.5965±0.6517 9.1417±8.6321 1.4196±1.0039 19.04±10.35＃●

ACL与PCL不同部分的破坏应力均取其发生破坏的那一时刻的载荷／初始横截面积计算得到。从统计学比较结果看，ACL与PCL不同部分的拉伸刚度、弹性模量、破坏应力没有显著性差异，表明来源相同、组织结构相似的生物材料只要处于生理受力范围内力学特征相同。破坏应变为材料的伸长值／原始长度，PLB与PMB的破坏应变较大，表明其受力后伸长值较大，延展性较好，抗拉伸能力较强，此结果进一步从材料力学角度证实了PLB与PMB较AMB与ALB在运动损伤发生率方面会存在一定差异。

4.3.3 本构方程

本构方程是表示固体中应力与应变关系的方程，是对生物材料在外力作用下响应的数学描述，有助于人们对生物材料特性的本质认识和深入分析［15］。先将AMB、PLB、ALB、PMB的应力松弛实验数据代入函数公式:“σe（ε）＝A（eBε-1）与G（t）＝Clnt＋D”计算得到常数“A”、“B”、“C”、“D”，然后再代入下列方程，即可得到ACL与PCL不同部分的本构方程。

表5 ACL与PCL不同部分本构方程常数一览表Table 5 Constitutive Equation Constants for Different Parts of ACL and PCL

5 结论

1.ACL与PCL各部分生物材料力学特性没有侧别差异，主要是由于其组织结构来源相同、双侧下肢功能相同所致。

2.AMB与ALB较之PLB与PMB更容易发生损伤，与其材料粘弹性、破坏应变等力学特性方面的差异有关。

3.在材料对负荷的瞬时弹性响应方面，AMB在被拉伸的初始阶段对使其变形所施加的外力反应较强；ALB随着材料的被拉伸长度的增加，对使其变形所施加的力反应呈现逐渐增强的现象。

4.ACL与PCL的不同部分拉伸刚度、弹性模量、破坏应力没有显著性差异，表明来源相同、组织结构相似的生物材料只要处于生理受力范围内，材料力学特征基本相同。

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