紫杉醇对人树突状细胞的生物活性的影响

杨 琨 董 武 荣 阳 赵艳敏 高笑天 汪 明 张 月 刘瑞雪

1.辽宁省人民医院中心实验室，辽宁沈阳 110016；2.中国医科大学辽阳中心医院放射科，辽宁辽阳 111000；3.上海柯莱逊生物技术有限公司，上海 201201；4.辽宁省人民医院消化二科，辽宁沈阳 110016

恶性肿瘤在我国居民疾病致死原因中位列第三，其中肺癌的致死率逐年上升。最近的研究数据显示，肺癌已经超过胃癌，成为所有癌症中每年致死人数最多的肿瘤[1]。目前肿瘤主要的治疗方法为外科手术切除，化疗、放疗。但肿瘤患者经过手术、常规化疗、放疗达到临床治愈后，体内仍残留肿瘤细胞，停止治疗后，残留的肿瘤细胞又开始增殖，经若干时间后会达到109个细胞，出现临床复发，这是治疗失败的主要原因之一。生物免疫治疗作为新的治疗方法最近得到了广泛的关注，其具有靶向杀伤、特异性高、不良反应小以及可以杀伤对化疗耐药的肿瘤细胞等优势[2-3]。目前在国内、外得到广泛应用的免疫细胞治疗是树突状细胞（dendritc cell，DC）和细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine induced killer cells，CIK）两种细胞联合治疗肿瘤，但传统治疗理念认为化疗药物可以杀死免疫细胞，所以生物免疫治疗经常在化疗间歇期进行，笔者查阅了一些国外的文献，认为只要掌握好化疗药物的剂量，在化疗期间也可应用免疫细胞治疗，本实验通过体外和体内两种途径，探究化疗药物紫杉醇对免疫细胞DC、CIK生物活性的影响和对抑制肿瘤能力的调控，为化疗期间同时应用免疫细胞治疗提供基础理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 肿瘤细胞株 肺癌A549细胞株来源于中国医科大学肿瘤研究所，由辽宁省人民医院生物治疗中心实验室体外传代培养。

1.1.2 药品及试剂 基因重组人IL-2（北京双鹭药业股份有限公司）、抗-CD3单抗（CD3McAb）、淋巴细胞分离液（Ficoll Paque Plus公司）、Triton X-100（德国Applichem公司）、基因重组人IFN-γ（上海凯茂生物医药有限公司）、白细胞介素-1（IL-1）、RPMI Medium 1640培养基（美国 GIBCO）、胎牛血清（美国 GIBCO）、PBS缓冲液、紫杉醇注射液、酶联免疫检测仪、全自动血细胞分析仪、24及96孔板、复方枸橼酸钠保存液、流式细胞检测抗体 anti-CD86-FITC、anti-CD40-PE、anti-MHCⅡ-PE、anti-IL-12-PE均来自 BD公司。LDH ELISA试剂盒。

1.1.3 实验动物 30只SPF级BALB/C裸鼠，购于北京华阜康科技股份有限公司，（许可证号：SCXK （京）2009-004），由沈阳中海生物技术开发有限公司动物中心饲养，雌性，鼠龄 6～8 周，体重 18～22 g。

1.2 方法

1.2.1 冻融法制备肺癌A549细胞抗原 消化收集对数生长期的A549细胞，用PBS液离心洗涤两次，再用PBS液重悬为1×1010个/L，封装入冻存管。置-80℃冰箱冷冻 10 min，重复 3次，然后，以 10 000 r/min离心30 min，取上清液-20℃保存备用。

1.2.2 DC细胞诱导、扩增 机采健康人外周血35 mL，用Ficoll密度梯度离心，分离单个核细胞。用PBS洗涤2次并计数。离心并将细胞重悬浮于RPMI 1640培养基中，置37℃、5%CO2培养箱培养2 h。收集非黏附性细胞于50 mL离心管中，用于诱导CIK细胞。在留有贴壁细胞的培养瓶中加入含有1000 U/mL rhGM-CSF和1000 U/mL rhIL-4的10%胎牛血清RPMI-1640培养液100 mL，分5组培养，分别在紫杉醇 5 ng/mL（b 组）、10 ng/mL（c 组）、20 ng/mL（d 组）、40 ng/mL（e组）的浓度下及不加紫杉醇的条件下（a组）培养DC细胞，每3天半量换液，同时补足上述rhGM-CSF及 rhIL-4， 置于 37℃、5%CO2培养箱培养，于DC培养第 5天加入10 μL/mL肺癌 A549细胞冻融抗原，第6天加入1000 U/mL肿瘤坏死因子，分别收集培养第7天的各组DC细胞，检测各组DC细胞的存活率，并用于其他实验。

1.2.3 各组DC细胞表型、细胞因子检测 各组DC细胞上清培养液用于IL-12的流式细胞检验。沉淀的细胞用 FACS 缓冲溶液（HBSS，2%FBS，0.05%NaAzide）洗涤，并用含有符合流式仪器要求的anti-CD86-PE、anti-CD40-PE、anti-MHCⅡ-PE抗体的 FACS重悬浮，在4℃下培养30 min。用FACS缓冲溶液洗涤两遍，用流式细胞仪分析，所得数据用FACSDiva软件分析（美国BD公司）。

1.2.4 CIK细胞的诱导和扩增 将上述诱导DC时收集的非贴壁细胞，调整细胞密度至1×106个/mL，用于CIK 细胞培养。 当天加入 IFN-γ（1000 U/mL），24 h后加入 CD3 单抗 （50 ng/mL）、IL-2 （300 U/mL）、IL-1α（100 U/mL），置于 37℃，5%CO2培养箱中，第 3 天以后视培养情况补液或传代，连续培养14 d，用于实验。

1.2.5 裸鼠肺癌肿瘤模型的建立 收集对数生长期的A549人肺癌细胞，离心弃上清，将细胞浓度调整为5×107/mL，取混匀的细胞悬液接种于裸鼠右侧腋下皮下，待肿瘤体积达到 500 mm3以上时，将肿瘤切成2 mm×1 mm×1 mm大小的瘤块，接种于新购裸鼠右侧腋下皮下，体内传3代后进行分组给药。

1.2.6 乳酸脱氢酶释放法（LDH）测定DC抗原传递能力 按文献[14]所建立的方法进行杀伤实验。取A549肺癌细胞株处于生长对数期的细胞，调整浓度至1×105/mL作为靶细胞置于37℃、5%CO2的培养箱中培养4 h。4 h后分别取紫杉醇处理 的DC（c组）和正常培养的DC细胞 （a组）5×105/mL与培养第 14天的CIK细胞1×107/mL共培养3 d作为效应细胞，进行杀伤实验：分别按照效靶比5、10、20（效应细胞数量按照1×107/mL计算）将效应细胞与靶细胞混合，500 r/min离心5 min，共同孵育于37℃、5%CO2的培养箱 6 h之后，离心1500 r/min离心10 min，取上清按照试剂盒说明在用酶标仪在450 nm处测量吸光值，计算杀伤活性：杀伤活性（%）=[（实验组 A值-总自然释放 A值）/（最大释放组A值-总自然释放A值）]×100%。总自然释放A值=靶细胞自然释放A值+效应细胞自然释放A值。

1.2.7 动物实验分组给药及检测指标 按照上述方法建立裸鼠肺癌模型，2 d后将30只裸鼠随机分成5组，分别为A组（对照组）：细胞株A549+盐水（NS）；B组：细胞株 A549+DC+CIK；C组：细胞株 A549+CIK+TAX；D组：细胞株A549+TAX；E组：细胞株A549+TAX+DC+CIK。各组具体用药情况见表1。每3天检测1次肿瘤大小，裸鼠存活时间，紫杉醇（TAX）按每只裸鼠20 mg/kg腹腔注射，CIK细胞为培养 14 d之后的成熟细胞，DC细胞按文中方法培养并激活，将各组细胞配成1×107/0.2 mL，尾部静脉注射连续 5 d，NS为生理盐水对照。瘤体积（V）=0.5×长径×短径的平方，计算每组裸鼠平均存活时间。

表1 各组用药情况

1.3 统计学方法

本实验所收集数据用SPSS 17.0软件进行统计学分析。计量资料采用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验，计数资料采用百分率表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 紫杉醇对于细胞存活率的影响

在共培养6 d的前提下，b、c组第 6天存活率与第0天存活率比较，差异无统计学意义（P＞0.05），说明DC细胞对于10 ng/mL以下的紫杉醇具有较好的耐受能力。浓度在10 ng/mL以上的紫杉醇会显著降低DC细胞的存活率，d、e组第 6天存活率与第 0天存活率比较，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。其中与浓度40 ng/mL的紫杉醇共培养6 d的DC细胞，存活率仅为17.5%。见图1。

图1 不同浓度的紫杉醇对DC细胞生存率的影响

2.2 紫杉醇对于细胞生物活性的影响

c组和e组CD86、CD40、MHCⅡ的表达以及IL-12的分泌与正常组相比有显著增加（P＜0.05）。d组除了CD86，其他检测指标较正常组均有显著统计学差异。b组中只有MHCⅡ较正常组有显著的统计学差异。说明低浓度紫杉醇（5 ng/mL）通过上调MHCⅡ的表达增强DC细胞抗原呈递的能力。中浓度紫杉醇（10 ng/mL） 可以上调 DC细胞上的 CD86、CD40和MHCⅡ的表达以及促进其IL-12的分泌，从而促进DC成熟并增强其抗原呈递能力。然而在高浓度下（20、40 ng/mL）紫杉醇抑制DC细胞的免疫活性。见图2。

2.3 LDH杀伤实验

c组 DC+CIK细胞在效靶比 5∶1和 10∶1的情况下，杀伤效果明显高于未经紫杉醇处理的a组DC+CIK细胞，差异有统计学意义（P＜0.05），其中紫杉醇处理组的细胞在效靶比为10∶1的情况下，杀伤活性已经到达（91.37±5.24）%，与 a组 DC+CIK细胞比较，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。见表2。

表2 a、c组不同效靶比情况下DC+CIK细胞杀伤效果比较（%，±s）

表2 a、c组不同效靶比情况下DC+CIK细胞杀伤效果比较（%，±s）

注：与 a组比较，*P＜0.05，**P ＜0.01

组别 5∶1 10∶1 20∶1 a组34.43±1.6072.78±4.7793.54±10.02 c组43.25±1.82*91.37±5.24**94.76±9.28

2.4 动物实验瘤体积以及存活时间

所有治疗组的治疗效果均明显好于对照组（P＜0.05），E组情况明显好于其他组（P＜0.01）。D 组在前25 d体现出较好的治疗效果，但是25 d后瘤体增长速度增加，最终与单用细胞治疗的治疗组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。C组与E组差异有高度统计学意义（P＜0.01），说明紫杉醇作用于DC细胞而非CIK细胞。见图3。B、C、D、E组的平均存活时间分别为 33.0、34.0、31.8、41.8 d，明显高于对照A组（23.8 d）（P＜0.05）。E组平均存活时间大于41.8 d，明显高于B、C、D 组（P ＜0.01）。其中E组45d仍有 3只存活。见图4。A组裸鼠于28 d全部死亡，B组34 d全部死亡，C组36 d全部死亡，D组36 d全部死亡，E组45d之后仍有3只存活。说明10 ng/mL以下紫杉醇能够有效地增强DC免疫活性，从而有效扼制肿瘤的生长，延长生存时间。见图5。

图3 瘤体积与时间的关系

图4 裸鼠平均生存时间

图5 裸鼠Kaplan-Meier存活曲线

3 讨论

近年来，肿瘤的综合治疗已经取代了传统的单一治疗，是继手术、放疗、化疗之后的第四种肿瘤治疗模式。生物治疗因安全、有效、毒副作用低等特点，被认为是目前肿瘤综合治疗模式中最活跃、很有前途的治疗手段，但传统治疗理念认为化疗药物具有较强的免疫抑制作用，因此很少与免疫细胞治疗同时应用。然而，最近研究发现，特定的一些化疗药物会在低浓度的情况下，促进机体免疫反应[4]。研究发现化疗药物有助于提高癌细胞的免疫原性[5-6]。Ding等[7]发现环磷酰胺与肿瘤过继细胞治疗 （adoptive cell therapy，ACT）联用可以有效促进CD4+T细胞的分化，CD4+T细胞可特异识别肿瘤细胞。所有这些发现都为免疫细胞联合化疗治疗肿瘤提供了理论基础。

DC是人体内专职的抗原提呈细胞，具有抗原提呈、激活初始T细胞、分泌免疫调节性细胞因子、分泌趋化性细胞因子、趋化T/B细胞等多种免疫调节作用。细胞因子活化的杀伤细胞（CIK细胞）共同表达CD3与CD56两种细胞因子。其主要组成为共表达CD3和CD56的T细胞。这种T细胞具有T淋巴细胞的杀伤活性以及自然杀伤细胞的非MHC限制的优点[7]。成熟的DC与CIK共培养，可以促进CIK的杀伤能力[8-10]。因此，DC细胞和CIK细胞作为免疫治疗中重要的两个部分，常联合应用以增强免疫治疗的临床疗效。

紫杉醇为广谱化疗药物，主要适用于卵巢癌和乳腺癌，对肺癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部癌、淋巴瘤、脑瘤的治疗。紫杉醇通过促进微管蛋白聚合来抑制有丝分裂，从而到达抑制肿瘤细胞生长的作用[11-12]。由于DC细胞极低的分裂能力，其对紫杉醇的耐受能力较强。本实验数据显示，在共培养6 d的前提下，5、10 ng/mL组第6天存活率与第0天存活率相比，差异无统计学意义（P＞0.05），存活率接近 100%，说明 DC细胞能耐受浓度在10 ng/mL以下的紫杉醇，紫杉醇浓度超过10 ng/mL对DC细胞的存活率有较大的影响，20、40 ng/mL组第6天存活率与第0天存活率相比，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。20 ng/mL的紫杉醇使DC细胞的存活率下降到45%；浓度40 ng/mL的紫杉醇共培养6 d的DC细胞，存活率仅为17.5%。此外，紫杉醇在中低浓度（5、10 ng/mL）下上调DC细胞表面MHCⅡ分子以及 CD40、CD86等共刺激分子表达，增强其呈递抗原、启动免疫应答的能力。本实验数据显示紫杉醇能显著上调DC细胞对于IL-12的分泌表达，但是具体上调机制还有待探究。IL-12有促进幼稚T细胞分化为Th1细胞的作用[13]，并能激活 NK细胞和T细胞，诱生 IFN-γ、TNF-α。本研究的体外杀伤实验中观察到紫杉醇预处理的DC细胞与CIK细胞共培养，CIK细胞的杀伤能力显著高于未处理的DC+CIK组。因为CIK细胞同时具备NK细胞和普通T细胞的特点，符合IL-12的作用特点，因此推测杀伤能力的上升可能与紫杉醇显著上调DC细胞IL-12分泌有关。

在体内实验中，所有治疗组肿瘤体积都明显小于对照组（P＜0.01），但 CIK组和 DC+CIK组并无明显的统计学差异。其原因有可能是CIK细胞的杀伤作用为非MHC依赖，而且DC在裸鼠体内不能找到除了CIK细胞以外的呈递抗原的效应细胞。单用紫杉醇治疗的化疗组在前25 d显现出较好的治疗效果，但是25 d后瘤体增长速度增加，最终与单用细胞治疗的治疗组无显著的统计学差距。其原因可能在于紫杉醇的抑瘤原理：虽然紫杉醇能通过促进微管蛋白聚合来抑制有丝分裂，从而有效地抑制处于生长周期中分裂期的肿瘤细胞的生长，但是对于其他微管蛋白表达低下时期的肿瘤细胞并无明显效果。然而，在紫杉醇体内药量衰减后，处于非分裂期的细胞进入分裂期，并大规模分裂，从而严重影响了紫杉醇药物的持续效应。紫杉醇+DC+CIK治疗组相对于其他治疗组差异有统计学意义（P＜0.05）。紫杉醇+DC+CIK治疗组裸鼠的存活时间比其他组有明显的统计学差异 （P＜0.05），其中在45 d之后仍有3只裸鼠存活。实验结果与上文所推测的紫杉醇增强CIK杀伤力的原理相符。

综上所述，低中浓度的紫杉醇可促进树突状细胞的成熟并提高其抗原呈递能力。高浓度紫杉醇可杀死树突状细胞，抑制其免疫活性。中浓度紫杉醇能促进树突状细胞分泌IL-12。紫杉醇、DC、CIK联合应用可提高荷瘤裸鼠生存时间。

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