温石棉及其代用纤维对鼠细胞EGFR及Survivin表达的影响

邓丽娟 王洪州▲ 王利民 董发勤

1.四川绵阳四〇四医院 川北医学院附属第二医院呼吸内科，四川绵阳 621000；2.西南科技大学校长办公室，四川绵阳 621000

国际上对温石棉的生物安全性存在较大争议[1-2]，一些学者认为温石棉的毒性和温石棉所带金属离子、表面电荷、产地等性质有较大关系。另一些学者认为温石棉的代用纤维也能够引起慢性肺炎，并且发现岩棉纤维可引起基因突变。也有学者认为温石棉与烟溶液联合对人胚肺细胞DNA的损伤具有协同作用[3-6]。由此可见温石棉的代用纤维对人体可能也不安全。本研究利用免疫组化的方法检测肿瘤基因表达，一方面拟证实其毒性，另一方面探讨其致癌的部分机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞来源

中国仓鼠肺细胞 （Chinese hamster lung cell，V79细胞）购买自四川大学华西医学中心生物医学实验室。

1.1.2 材料与试剂

温石棉、四川新康温石棉、陕西陕南温石棉、玻璃纤维、陶瓷纤维、硅灰石、岩棉来自四川西南科技大学实验室。兔抗鼠EGFR、Survivin单克隆抗体购于武汉博士德公司。免疫组化SABC试剂盒（SA1022）购于武汉博士德公司。

1.2 方法

1.2.1 制备实验组粉体及其悬液

将各实验原矿处理成5 μm左右长，具体方法：将实验原矿反复碾压、劈分、剪短后，然后再进行细研磨，之后进行筛选过滤；然后烘干，最后研磨成更细的粉体。电镜图片见图1。用高温杀菌消毒各种实验粉体，配置成 6 个不同浓度：1、2、4、6、8、10 mg/L。

图1 温石棉及其代用品粉体的扫描电镜图

1.2.2 免疫组织化学检测肿瘤基因EGFR及Survivin的表达

1.2.2.1 实验分组 实验共分为7组，实验组包括四川新康温石棉组（A组）、陕西陕南温石棉组（B组）、玻璃纤维组（C组）、陶瓷纤维组（D组）、硅灰石组（E组）、岩棉组（F组），并设阴性对照组（G 组）。

1.2.2.2 干预及检测方法 预先将处理后的盖玻片放入6孔板里，将细胞接种到盖玻片上，细胞量为2×105/孔。将调整好的细胞悬液1 mL，分别加入到培养板各孔中。然后把接种到培养板的细胞放入到CO2细胞培养箱中培养24 h。将6种粉体6个不同浓度（1、2、4、6、8、10 mg/L） 的悬液分别取 1 mL 滴到各细胞培养孔中。将染毒的细胞放到CO2细胞培养箱中继续培养48 h后进行免疫组化检测。设阴性对照组，不加入上述任何粉体悬液，其他步骤同上。Survivin以及EGFR的免疫组织化学染色根据SABC法进行，其主要步骤如下：①将染毒的细胞放到CO2细胞培养箱中继续培养48 h后，吸尽6孔板培养皿中的培养液，滴入丙酮处理30 min，吸尽每孔中的丙酮，蒸馏水冲洗3次。②30%的H2O21份+纯甲醇50份混合，室温浸泡30 min，以灭活内源性过氧化物酶，蒸馏水冲洗3次。③滴加正常山羊血清封闭液，室温20 min，甩去多余液体，不洗。④每孔滴入一抗，Survivin以及EGFR稀释度为 1∶200，37℃下孵育 60 min， 然后置 4℃冰箱过夜。⑤室温下复温 20 min，PBS（pH 7.2～7.6）冲洗 5 min×3次。⑥滴加生物素化羊抗兔IgG，37℃ 20 min，PBS（pH 7.2～7.6） 洗 2 min×3 次。 ⑦滴加试剂 SABC，37℃20 min，PBS（pH 7.2～7.6）洗 5 min×4 次。⑧新鲜配制的DAB溶液显色5 min。⑨自来水冲洗后苏木素复染，常规脱水封片。

1.2.2.3 免疫组化染色结果判断及分析 阳性结果判断标准为细胞浆、细胞膜或胞核呈棕黄色。倒置显微镜下随机选取 3个视野（10×40），用 Image-ProPlus专业图像分析系统检测其平均光密度值（OD）值，再进行统计学分析处理。

1.3 统计学方法

采用SPSS 21.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

各实验组及阴性对照组的免疫组化染色结果见图2～5，OD 值测定结果见表1～2。 EGFR、Survivin 在阴性对照组未见表达 （图4、5）；Survivin的阳性表达主要在细胞浆，细胞膜和细胞核有少量表达；EGFR的表达主要分布于V79细胞的细胞浆，在细胞核亦有少量表达。不同浓度温石棉及其代用品粉体悬液染毒 V79细胞后，A组及 B组与其他组比较，EGFR、Survivin的表达最强，差异有统计学意义（P＜0.05）；A组与B组相比较，EGFR、Survivin的表达差异无统计学意义 （P＞0.05）；各组随粉体浓度增加，EGFR、Survivin的表达均逐渐升高，差异有统计学意义（P＜0.05），呈现浓度依赖性。

图2 EGFR在陕西陕南温石棉组中的表达（10×20）

图3 Survivin在四川新康温石棉组中的表达（10×20）

表1 Survivin在各组 V79细胞中的表达（±s）

表1 Survivin在各组 V79细胞中的表达（±s）

注：“-”代表不表达

组别 1 mg/L 2 mg/L 4 mg/L 6 mg/L 8 mg/L 10 mg/L A组0.381±0.0070.413±0.0080.436±0.0090.473±0.0090.529±0.0060.593±0.009 B组0.390±0.0080.415±0.0070.439±0.0080.478±0.0060.537±0.0100.618±0.008 C组0.324±0.0090.365±0.0060.399±0.0050.428±0.0060.487±0.0080.549±0.006 D组0.288±0.0050.328±0.0060.365±0.0070.396±0.0040.445±0.0090.499±0.008 E组0.199±0.0070.269±0.0050.316±0.0060.355±0.0070.409±0.0090.458±0.008 F组0.099±0.0060.116±0.0050.158±0.0070.198±0.0060.229±0.0080.268±0.012 G组------

表2 EGFR在各组V79细胞中的表达（±s）

表2 EGFR在各组V79细胞中的表达（±s）

注：“-”代表不表达

组别 1 mg/L 2 mg/L 4 mg/L 6 mg/L 8 mg/L 10 mg/L A组0.349±0.0060.399±0.0080.438±0.0080.478±0.0080.528±0.0070.588±0.018 B组0.348±0.0080.408±0.0080.448±0.0080.485±0.0070.529±0.0170.609±0.007 C组0.318±0.0070.359±0.0060.395±0.0050.427±0.0060.479±0.0080.528±0.006 D组0.269±0.0060.305±0.0040.348±0.0050.399±0.0040.438±0.0100.489±0.006 E组0.179±0.0040.238±0.0080.287±0.0050.328±0.0070.381±0.0050.439±0.007 F组0.070±0.0040.125±0.0050.169±0.0040.205±0.0090.248±0.0080.289±0.019 G组------

图4 EGFR在阴性对照组中呈阴性表达（10×20）

图5 Survivin在阴性对照组中呈阴性表达（10×40）

3 讨论

EGFR属于表皮生长因子家族（erbB家族），该家族包括 EGFR、C-erb-2、C-erb-3、C-erb-4。 EGFR 是原癌基因C-erb的表达产物，具有酪氨酸激酶活性，分子量为170 kD，由上千个氨基酸残基组成。EGFR过度激活使其介导的信道环节受到影响，抑制凋亡，促进肿瘤血管生成，EGFR在很多肿瘤中均有明显的过表达，尤其在肺癌中的表达高达53.1%～69.7%[7-9]。

Survivin具有调节细胞分裂的和抑制细胞凋亡两种功能，是众多凋亡抑制蛋白中分子量最小的，它的表达产物是目前学术界认为最强的凋亡抑制蛋白。Survivin抗凋亡作用既通过与纺锤体纤维结合，间接抑制caspase对纺锤体的水解作用，有利于保护有丝分裂细胞器的完整性，抑制细胞凋亡；通过阻断线粒体细胞色素c释放，直接抑制凋亡效应因子，使其活性消失[10-11]。

从本实验结果可以看出，不同浓度温石棉及代用品粉体处理V79细胞可使细胞受损，从而诱导上皮细胞EGFR、Survivin基因表达的上调，随着暴露浓度的增加，EGFR、Survivin的表达呈进一步上调趋势。由此可见，温石棉及其代用品具有潜在致癌性，其部分机制可能为上调肿瘤基因EGFR和Survivin的表达，进而诱发细胞癌变。但是，从实验本身来说，还存在两方面的问题：首先，样本量并不很足，每组数据使用3次实验测定结果取平均值。其次，温石棉以及其代用品的如何影响EGFR、Survivin的表达、通过什么物质进行影响、影响通道是什么还需要进一步考察。笔者认为，在后期的试验中，应适当增加A组以及B组的样本量，仔细考察温石棉以及其代用品对于EGFR、Survivin的作用途径。但是，总的来说，本文为后期实验做出了铺垫作用，通过本文实验数据分析，温石棉及其代用纤维对于与鼠细胞EGFR及Survivin表达有显著的增强作用。

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