以污泥提取液为生长介质的纤细角毛藻培养与CO生物固定*2

孟范平，李祥蕾，谢 爽，于 腾，程凤莲

（中国海洋大学海洋环境与生态教育部重点实验室，山东 青岛，266100）

近几十年来，因化石燃料广泛使用排放的CO2对全球变暖的贡献受到越来越多的关注。目前，地球大气层中CO2浓度约为392mg／L，并正以2.0mg／（L·a）－1的速度上升［1］。为了降低工业排放的CO2数量，1990年代以来，国内外学者对工业CO2的捕获技术进行了大量研究，其中，生物方法特别是基于微藻的CO2生物固定技术受到更多关注，主要是因为微藻细胞以指数形式增长，其光合固碳效率大大高于其他陆地植物，能够更为有效地利用CO2。借助光生物反应器对光照、温度、pH值、气液传质等因子的控制，可以为微藻提供适宜的生长条件，进一步提高固碳效率［2］，且藻细胞富含脂肪酸甲酯（Fatty Acid Methyl Esters，FAMEs）等脂类，是制备生物柴油的良好原料［3］。然而，光生物反应器运行期间，必需向海水中加入含氮、磷的无机盐以满足微藻生长对营养物质的需要。据国家土肥和农业发展中心的统计资料，磷酸氢二铵和尿素的价格分别上升 US＄500／t和 US＄143／t［4］。另据报道，生产1kg微藻生物柴油需要0.33kg无机氮和0.71kg磷酸盐［5］，这意味着微藻培养及其固碳过程中需要消耗大量的无机营养盐，由此产生的过高固碳成本将限制微藻大规模培养及其在工业CO2固定中的应用。城市污水厂污泥中含有丰富的氮、磷营养物质，其提取液可作为营养源替代传统培养基而用于海洋微藻培养［6］，有效降低微藻的固碳成本，增强其在工业CO2减排中的应用潜力。

纤细角毛藻（Chaetoceros gracilis）是海洋中的1种单细胞微藻，属于硅藻门。笔者的前期研究表明，该微藻不仅具有较强耐酸性，还能在浓度15%的CO2中正常生长［7］，表明其能够适应持续通入含CO2的工业烟道气的恶劣环境，具有固定高浓度CO2的应用潜力。本研究将污泥提取液与海水按一定比例混合作为培养液，通过正交试验优化培养条件，将接种微藻后的培养基引入自制的光生物反应器中进行动态循环培养，确定适宜运行条件，以期为污泥提取液应用于微藻大规模培养，最终实现CO2的高效生物固定提供科学依据。

1 材料、仪器和方法

1.1 材料

微藻藻种 纤细角毛藻（Chaetoceros gracilis）由中国海洋大学藻种库提供。使用前，将微藻接种到F／2培养基中，在温度25℃、光照强度4 000lx、光照时间24h／d的条件下预培养2～3d至指数生长期。

海水 取自青岛石老人近岸海域，避光静置24h后经0.45μm醋酸纤维滤膜抽滤，煮沸灭菌，冷却备用。F／2培养基 按照文献［9］的方法配制。

CO2气体 浓度（体积比）为99.99%，装于40L高压钢瓶内，青岛市瑞丰气体有限公司生产。使用时，与空气按一定体积比混合，配制成CO2浓度5%、10%、15%、20%的气体。

1.2 仪器装置

YS2－H型显微镜（Nikon公司），ELⅢ型元素分析仪（德国瓦里安公司），JY92－II型探头式超声发生器（宁波新芝科技股份有限公司），GXZ－280B型智能光照培养箱（宁波江南仪器厂），GL－20J－Ⅱ高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）。

螺旋管光生物反应器：自制，有效容积10L，见图1。整体上分为3部分：①螺旋管光照区，由4组螺旋管和日光灯管（固定在灯架上）组成，螺旋管选用透明的PVC管（内径8mm，管壁厚1mm），均匀缠绕于圆柱状有机玻璃管上，螺旋个数40，每组螺旋管的容积500mL；螺旋管间由橡胶管串联；日光灯（23W）固定于有机玻璃管中央部位。②动力驱动区，由储液罐（圆柱体，容积10L）、蠕动泵组成。罐顶部设有藻液入口、取样口、出气口；罐底部设有藻液出口和收集口；培养液的循环流量通过蠕动泵的换挡来实现。③辅助区，包括CO2钢瓶、电源、恒温装置（光照培养箱）。使用前，将接种好的培养液装入储液罐内，开启电源，调节培养箱温度至所需温度，启动蠕动泵调节流速档使藻液循环流量至设计值，钢瓶CO2气体与空气经三通阀进入流路与藻液充分混合，随藻液被输送至螺旋管光照区，通过微藻的光合作用吸收利用培养液中的CO2，依次流过4组螺旋管后，再回到储液罐内，如此不断循环。

图1 螺旋管式光生物反应器示意图Fig.1 Schematic drawing of the helical photo bioreactor

1.3 试验方法

1.3.1 污泥提取液－海水培养液中的微藻适宜生长条件静态条件下，采用正交试验方法对微藻培养体系的光照强度、温度、污泥提取液与海水混合比、通入CO2的浓度（v／v）进行优化，因素及水平见表1。初始接种密度1×105cells·mL－1，光照时间24h·d－1，培养7d，以微藻生物量为评价指标，确定基于污泥提取液＿海水混合体系的纤细角毛藻最适培养条件。

1.3.2 光生物反应器的运行条件优化 按1.3.1节优化的微藻适宜生长条件，采用单因素影响试验，探讨光生物反应器培养纤细角毛藻的适宜运行条件。各因素及水平分别为：初始接种量（1×105cells·mL－1，1×106cells·mL－1，3×106cells·mL－1）、藻液循环流量（600mL·h－1，1 200mL·h－1，2 400mL·h－1）。每天定时采集藻液测定生物量，以之为评价指标确定适宜运行条件。运行过程中，CO2流量过高会使藻液在光照区中的停留时间大大缩短，进而导致CO2的利用率较低；而当CO2流量过低时，气体压力较小，不足以保证CO2随培养液进入反应器的螺旋管内，因此，控制CO2流量20mL·min－1。

1.3.3 微藻生长指标测定 藻细胞密度：血球计数板计数法，单位为cells·mL－1。

大众化教育时代研究生导师与学生和谐关系的构建 … ……………………… 袁 静，杨剑萍，郭 成（6．103）

藻生物量：将10mL培养液在5 000r·min－1转速下离心15min后，弃去上清液，以pH＝4的稀盐酸冲洗藻泥3次，用0.45μm滤膜抽滤，于80℃烘至恒重，用分析天平准确称量。藻生物量为藻泥干重与培养液体积之比，单位为g·L－1。

1.3.4 反应器中微藻的固碳速率计算

表1 正交试验的因素水平表Table 1 Factors and levels in the orthogonal experiments

式中：V 为固碳速率（g·L－1·d－1）；（M－m）为藻生物量产率（g·L－1·d－1），即相邻（间隔1d）的2次藻生物量测定值之差；C为微藻的含碳率（本研究采用元素分析仪测得的纤细角毛藻含C率为0.508）。

1.3.5 反应器中培养液的营养盐测定与去除率计算

取上述藻生物量测定过程中的离心上清液，参照《水和废水监测分析方法》［10］测定其中的营养盐浓度。硝酸盐氮（－N）：锌镉还原法；氨态氮（NH4＋－N）：次溴酸盐氧化法；亚硝态氮（NO2－－N）：萘乙二胺分光光度法；磷酸盐－P）：磷钼蓝分光光度法。按下式计算营养盐去除率（）：

微藻的固碳速率按下式计算：

式中：C0和CT分别为每种营养盐的起始浓度和培养T 天后的浓度（mg·L－1）。

2 结果与讨论

2.1 污泥提取液－海水混合体系中纤细角毛藻的培养条件优化

表2为优化微藻培养条件的正交试验结果。可见，确定接种密度1×105cell·mL－1时，各试验组的纤细角毛藻均能正常生长，但生物量存在较大差异：最小的为0.03g·L－1（试验15），最大的为0.86g·L－1（试验10）。根据极差R大小判断，4种影响因素中，以A（通入培养液中的CO2浓度）对纤细角毛藻生长影响最大（R为0.563），通入浓度20%CO2的4个试验中生长情况较差，培养5d后观察到培养液中的微藻呈白色；其次为D温度（R为0.489）；而B（污泥提取液与海水混合比）、C（光照强度）对纤细角毛藻生长的影响较小（R 分别为0.182和0.142）。

2.1.1 CO2浓度的影响分析 CO2浓度变化能够显著影响纤细角毛藻生长，表现为CO2浓度由5%增加到10%时，藻生物量的均值由0.545增加到0.652 g·L－1；继续增加CO2浓度到15%时，藻生物量的均值有所下降，为0.455g·L－1；当CO2浓度增至20%时，藻生物量均值急剧下降到0.089g·L－1。文献［11］发现［11］，在通入不同浓度（2%～15%）CO2的微绿球藻（Nannochloropsis oculata）半连续培养系统中，以2%CO2对应的藻生物量产率最大（（0.480±0.029）g·L－1·d－1），而15%CO2对应的藻生物量产率最低（（0.372±0.022）g·L－1·d－1）。高浓度CO2对藻细胞生长产生有害影响的原因可能是：①高浓度CO2通入使得溶解态CO2向细胞质膜内的扩散速率增加，导致藻细胞内的H＋浓度增加，这种酸化对藻细胞质具有“毒性”作用，使捕光色素蛋白复合体和反应中心复合体受损或部分降解［12］，导致光合色素含量降低；②高浓度CO2条件下，大多数CO2消耗在微藻的代谢活性上，即微藻通常采取减少PSⅡ系统活性和减少非循环光合磷酸化的能量分配策略，以及增加PSⅠ系统中循环性光合磷酸化的能量配比，以分配更多的ATP用于维持细胞内pH值的稳定，因此只有少量的CO2经生物固定成为藻细胞的组分［11］。本研究中，虽然纤细角毛藻耐受CO2的浓度极限为15%，但通入10%CO2时出现最大生物量（对应最大CO2利用效率），表明纤细角毛藻在此浓度下生长最快。

表2 利用提取液－海水混合液培养纤细角毛藻的正交试验设计与结果Table 2 Designs and results of the orthogonal experiments for the cultivation of Chaetoceros gracilis

2.1.2 温度的影响分析 温度是调节微藻细胞、形态学和生理学响应的主要因子之一，对微藻生长和固碳能力影响很大。低温（16℃以下）会抑制生长，随着培养温度逐渐升高，微藻代谢速率增大，细胞的比生长速率升高［13］。适宜温度下，藻细胞的酶活性最高，比生长速率达到最大。当超过微藻生长的极限温度后，因细胞内调节代谢的某些酶活性受到抑制，比生长速率呈直线下降，温度高于35℃时将造成许多藻种死亡［14］。本研究所用的纤细角毛藻属暖水性海洋微藻，由表2可见，温度对其生长的影响较大，仅次于CO2浓度。在设置的温度范围内（20～35℃），纤细角毛藻均可生长，只是在20℃下的生长速度较低；随着温度升高，藻细胞的代谢和呼吸作用旺盛，至30℃时生长速度最快；当温度继续上升至35℃时，藻生物量有所下降。因此，纤细角毛藻在混合液中的最适生长温度为30℃。这与前人报道的纤细角毛藻最适温度范围（30～32℃）相符［15］。

2.1.3 营养盐的影响分析 污水污泥除了含有丰富的N、P等营养成分外，还含有一定量的铝、铁、硅无机盐以及重金属等有害成分［6］。本研究采用超声处理制备的污泥提取液中，无机氮（IN）和PO3－4－P的浓度分别达351.5和115.0mg·L－1，是F／2培养基中相应成分的28.6倍和101倍。这种污泥提取液直接用于培养微藻，可能因有害成分浓度过高而抑制微藻的正常生长；此外，微藻培养期间无法充分利用提取液中大量的N、P营养盐，也会造成营养资源的浪费。因此，研究中，预先按照一定的体积比将海水与污泥提取液混合后，再用于微藻培养。表2的结果表明，体积比1∶29的混合培养液最适于纤细角毛藻生长，培养结束时的藻生物量均值为0.547g·L－1。

2.1.4 光照强度的影响分析 本研究中，光照强度是对纤细角毛藻生长影响最小的1个因素。由表2可以看出，在污泥提取液－海水混合体系中，纤细角毛藻的最适光照强度为6 000lx。当低于或高于此值时，都会造成藻生物量的降低。这是因为，随着光照强度增加，光强对微藻生长的影响分为光限制、光饱和、光抑制等类型。每种微藻具有自己的最适光强，低于最适光强时，光强成为微藻生长的限制因子，此时微藻的光合效率随着光强的增加而增加；当光强达到一定值后，光合作用效率几乎不再增加而保持稳定（即光饱和效应）；光强继续增加到远大于光饱和点时，藻细胞的叶绿体PSⅡ系统会受到损坏，导致氧释放系统、电子载体的失活，光合作用效率就会下降（即光抑制现象）［16］。

综上所述，以污泥提取液－海水混合液培养纤细角毛藻的最适条件为：CO2浓度（v／v）为10%，污泥提取液与海水的体积比为1∶29，温度为30℃，光照强度6 000lx。

2.2 光生物反应器中微藻固碳的运行条件

将纤细角毛藻接种到污泥提取液与海水的混合液中，在螺旋管式光生物反应器中进行培养，控制培养条件为上述优化值，以研究接种密度、循环流量变化对藻生物量的影响。

2.2.1 适宜接种密度的确定 微藻培养过程中，适宜的接种量能够有效缩短细胞的延迟生长期，使细胞快速进入对数生长期［15］。对于光生物反应器而言，微藻培养周期的缩短意味着生产效率和CO2固定速率的提高。在藻液循环流量保持不变（600mL·h－1）的情况下，本研究采用文献常用的3个接种密度［17］，分别测定反应器运行期间的藻生物量变化（见图2）。

可见，当接种密度较低（1×105cells·mL－1）时，纤细角毛藻生长的延迟期较长，在对数生长期的生物量积累较少；当接种密度为1×106cells·mL－1时，延迟期较短，2～5d内的生物量增加值达到0.65g·L－1，增幅最高；当接种密度为3×106cells·mL－1时，纤细角毛藻虽然只经过较短延迟期即进入对数生长期，但是其生长停滞期也很快出现，培养5d就进入停滞期，不利于获得最大生物量或最高固碳速率。因此，选择1×106cells·mL－1为最佳接种密度。

2.2.2 适宜的藻液循环流量确定 由图3可见，当藻液循环流量由600mL·h－1增加到1 200mL·h－1时，培养7d后的藻生物量由0.85增加到0.91g·L－1；当循环流量为2 400mL·h－1时，培养7d后的藻生物量最低，仅为0.48g·L－1。这是因为，过高的循环流量虽然增加了微藻在单位时间接受光照的频率，但是每次循环中藻细胞在光照区的停留时间太短，得不到充足光能，使光合作用降低。另外，流速过快时，液流对微藻产生一定剪切力，也不利于微藻生长［17］。反之，较低的循环流量不仅延长了微藻在反应器中的循环周期，相对增加了藻细胞处于非光照区的时间，总体光合效率和培养期间的生物量都会降低，而且微藻容易在螺旋管内沉淀，难以保持受光均匀，造成微藻的光合效率下降。因此，为使微藻在反应器中有较高的生物量，适宜的藻液循环流量为1 200mL／h。

图3 培养液循环流量（mL·h－1）对光生物反应器中纤细角毛藻生物量的影响Fig.3 Effect of the flow rate（mL·h－1）of culture solution on the growth of Chaetoceros gracilis in the photobioreactor

2.3 光生物反应器中纤细角毛藻的固碳效果

在2.1节和2.2节确定的纤细角毛藻培养条件和反应器运行条件下，接种纤细角毛藻后，使螺旋管式光生物反应器连续运行1个周期（7d），逐日测定藻生物量的变化，结果见表3。纤细角毛藻在光生物反应器中的延迟期为2d，从第3天起即进入对数生长期。运行期间，以第5天的藻生物量产率和固碳效率最大，分别为0.36和0.67g·L－1·d－1。通过表4对比发现，本研究所用的纤细角毛藻（Chaetoceros gracilis）（0.67g·L－1·d－1）在光生物反应器中的最高固碳效率高于蛋白核小球藻（Chlorella kessleri）（0.33g·L－1·d－1）、普通小球藻（Chlorella vulgaris）（0.26g·L－1·d－1）和 螺 旋 藻（Spirulinasp.）（0.51g·L－1·d－1），略低于海洋绿球藻（Chlorococcum littorale）（0.85g·L－1·d－1）。

表3 优化工作条件下光生物反应器中通入浓度10%的CO2后藻生物量和固碳速率逐日变化Table 3 Daily change of biomass and carbon sequestration capacity of Chaetoceros gracilis cultured in the photobioreactor under the optimized working conditions

表4 不同藻种在其最适宜培养条件下最大固碳速率比较Table 4 The maximum carbon sequestration capacity of different microalgae under their optimized cultural conditions

2.4 光生物反应器中营养盐的利用程度

本研究同时测定了光生物反应器中纤细角毛藻对培养液中营养盐的利用程度。由表5可见，培养7d后，培养液中的营养盐被纤细角毛藻快速吸收利用，的去除率分别达到96.9%、93.3%、78.0%和88.5%，进一步表明污泥提取液中的氮、磷营养盐可以作为纤细角毛藻的生长介质。在利用微藻进行CO2的大规模固定时，污泥提取液的使用将大大降低固定成本，使微藻固碳技术更具应用潜力。

表5 优化工作条件下培养液中营养盐的去除程度Table 5 Nutrient removal potential from culture medium under the optimized working conditions

3 结论

（1）在污泥提取液和海水的混合体系中，连续通入高浓度CO2的情况下，CO2浓度对纤细角毛藻生长影响最大，浓度20%的CO2对微藻生长的抑制作用最大。最适培养条件为：CO2浓度为10%，污泥提取液与海水按1∶29的体积比混合，温度30℃，光照强度6 000 lx。

（2）将接种纤细角毛藻的污泥提取液－海水混合液在螺旋管式光生物反应器循环运行，用于浓度10%的CO2吸收固定，适宜的运行条件为：CO2流量20mL·min－1，初始接种量1×106cells·mL－1，藻液循环流量1 200 mL·h－1。

（3）在优化的培养条件和运行条件下，光生物反应器中纤细角毛藻的最大藻生物量产率和固碳速率出现在培养5d后，分别为0.36和0.67g·L－1·d－1。同时，培养液中氮、磷营养盐的利用程度较高，NO－3－N、NH＋4－N、NO－2－N、PO3－4－P的去除率分别达到96.9%、93.3%、78.0%和88.5%。利用污泥提取液替代传统培养基，将大大降低微藻固碳成本，使其更具应用潜力。

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