穴位埋线对慢性萎缩性胃炎大鼠血清 CRP 、IL-6 、TNF-α的影响

樊永磊,李素荷,钟国新,陈 璐,张 璇

（广州中医药大学针灸推拿学院,广州 510405）

慢性萎缩性胃炎（chronic atrophic gastritis,CAG）是慢性胃炎的一种分型,病理是固有腺体减少,慢性萎缩性胃炎的病情复杂,是胃癌前状态最常见的一类[1]。中医学认为本病的病因病机多为饮食不节、劳倦过度、七情失和、表邪入里、脾胃素虚等因素反复作用,致使脾失健运、胃失和降而发病[2-3]。本病多为本虚标实之证,治疗时治本当健脾益气滋阴和胃,标实当理气活血平调寒热[4]。本研究即通过复制慢性萎缩性胃炎大鼠模型,观察慢性萎缩性胃炎炎症反应过程中血清中某些炎性因子的表达,并重点观察穴位埋线的干预效应,为临床开展针灸治疗慢性萎缩性胃炎提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 选用75只8周龄SD大鼠（由广东省医学实验动物中心提供,许可证号:SCXK粤2008-0002）,体质量180～220 g,采用架式笼养,恒温（20±1）℃,湿度50%～60%,光照、黑暗各12 h交替,自动通风8～15次/h条件下饲养。所有动物用标准饲料喂养1 w后,将实验动物按体质量编号,用随机数字表法将75只大鼠分为空白组25只、造模组50只。

1.2 主要试剂及用品 1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍（MNNG,日本东京化成工业株式会社生产,批号GNGMH）;75%乙醇（安徽安特生物化学有限公司生产,批号1107134101）;4-0医用羊肠线（上海浦东金环医疗用品有限公司生产,批号13M1103）;华佗牌30号1.5寸不锈钢针灸针（苏州医疗用品厂有限公司生产,生产日期201103）;金雅碘消毒液（珠海卉美生物科技有限公司生产,生产日期20110613）;10%中性缓冲福尔马林固定液（广州维格斯生物科技有限公司生产,批号 11011301）;TNF-αElisa试剂盒（R&D Systems公司生产,批号295252）;IL-6 Elisa试剂盒（R&D Systems公司生产,批号293832）;CRP Elisa试剂盒（Abcam公司生产,批号GR78073）。

1.3 慢性萎缩性胃炎大鼠模型的建立 参考李守朝等[5-7]的慢性萎缩性胃炎大鼠模型复制方法,采用1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍（MNNG）造模方法干预造模组50只大鼠,先将MNNG用蒸馏水配成1 g/L的储存液,4℃冰箱避光冷藏保存,使用时再用饮用水配成100 mg/L浓度的溶液给大鼠自由饮用（用锡纸包裹饮水瓶）,每24 h更换1次,并记录每日饮用溶液量,同时配合饥饱失常方法,单日足量喂食,双日禁食。连续造模8 w后开始每隔1 w剖杀造模大鼠4只,取胃组织10%中性福尔马林中固定后作病理检查,观察模型复制情况直至符合慢性萎缩性胃炎病理诊断,提示模型复制成功。造模时间约为10w。空白组自由饮水及饮食的条件下正常喂养。

1.4 模型建立后处理 造模成功后剩余造模组大鼠39只（造模过程中死亡3只,考虑为MNNG毒性致死;检测模型复制情况剖杀8只）,空白组大鼠23只（病理对照剖杀2只）,随机检杀空白组6只、造模组6只对照观察。剩余空白组17只、造模组33只,按随机数字表法将造模组分为埋线组17只、模型组16只。

1.4.1 空白组 空白组自由饮水及饮食的条件下正常喂养。

1.4.2 埋线组 埋线组于造模成功后开始治疗,选取大鼠“足三里”“中脘”“脾俞”穴,穴位的定位选取根据林文注等主编的《实验针灸学》[8],以比较解剖和骨度分寸法为依据,后三里:相当于人体“足三里”的膝关节外侧腓骨小头下约5 mm,胫腓骨间隙中;中脘:脐上约20mm处（脐中在大鼠胸腹正中线胸骨柄上缘至外生殖连线上3/4与下1/4交界点取之）;脾俞:第十二胸椎下两旁。穴位用碘消毒液消毒,将0.5 cm长4-0号铬制羊肠线从6号注射针头的针尖处装入针体（此时注射针头内作为针芯的华佗牌30号1.5寸不锈钢毫针稍退后）,线头与针尖内缘齐平,背腰部穴位在局部下方向上平刺,腹部斜刺、下肢穴位直刺,刺至所需深度,边推针芯,边退针管,将羊肠线埋植于穴位皮下组织或肌层内,线头不外露,消毒针孔。10 d治疗1次,共治疗6次。

1.4.3 模型组 模型组造模成功后相同条件下正常喂养,不治疗。

1.5 治疗后处理 疗程结束后各组情况如下:空白组17只（检测指标13只,其他检测4只）,埋线组17只（检测指标12只,其他检测4只,因操作不当死亡1只）,模型组16只（检测指标12只,其他检测4只）。对3组大鼠分别按前述研究方法完成大鼠血清CRP、IL-6、TNF-α含量测定,并完成实验数据的分析处理。

1.5.1 一般状态观察 对各组大鼠的体质量、毛色、精神状态及活动情况进行观察、对照。

1.5.2 血清中 CRP、IL-6、TNF-α含量检测 大鼠不禁水,禁食24 h,乙醚麻醉下,仰卧固定于手术板上,剪开腹部,抽取大鼠腹主动脉血5 mL,离心后取上清液,置-20℃冰箱保存,采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测血清中 CRP、IL-6、TNF-α,具体步骤严格参照试剂盒说明书操作。

1.6 统计学处理 数据采用SPSS 17.0统计分析软件处理,计量资料所有数据以（±s）表示,两组间样本均数的比较选用单因素方差分析,方差齐且服从正态分布采用q检验（SNK法）,方差齐性检验水平为α=0.05;否则采用非参数检验。

2 结果

2.1 一般情况观察 空白组大鼠精神良好,每日食量30～50 g,体质量增长稳定,毛发致密,色为白色有光泽,活动灵敏,大便呈黄黑色颗粒状;造模组大鼠精神萎靡,平均每日食量20～40 g,体质量增长缓慢,毛发稀疏呈萎黄色,反应较空白组迟钝,大便呈黑色略溏。埋线组经治疗出现精神好转,食欲增加,活动灵敏度增加,毛色稍黄。

2.2 大鼠胃黏膜病理学检查

2.2.1 大体观察 空白组大鼠胃壁弹性良好,皱襞表面光滑而规整,表面覆有较多黏液,黏膜呈淡红色,有光泽,不见出血点;埋线组胃黏膜呈淡红或暗红色,皱襞较规整,有少量黏液附着,可见散在出血点,表面尚平滑。

2.2.2 光镜下检查 空白组:胃黏膜层厚度大,上皮细胞及腺体排列整齐,大小形状一致,细胞呈单层柱状,胞质透明或空泡状,腺体丰富与胃小凹分界清晰,固有腺及黏膜无充血、水肿,黏膜肌层无增生（图1）。

模型组:胃黏膜层变薄,肌层增宽,胃小凹变浅,腺体变小,排列紊乱,数量减少,并有囊性扩张,间质有纤维组织增生,及淋巴细胞浸润,可见肠上皮化生现象（图2）。

埋线组:胃黏膜均有不同程度好转。可见胃黏膜厚度适中,腺体排列较为规则。细胞形态较均一,炎细胞浸润主要局限于黏膜浅层,固有腺体保持相对完整。个别大鼠胃体仍有腺体萎缩等萎缩性胃炎表现,但无明显坏死（图3）。

图1 空白组（HE染色×100）

图2 模型组（HE染色×100）

图3 埋线组（HE染色×100）

2.3 埋线对慢性萎缩性胃炎大鼠血清C反应蛋白CRP、IL-6、TNF-α的影响 见表 1。

表1 埋线对慢性萎缩性胃炎大鼠血清CRP、IL-6、TNF-α的影响（±s）

表1 埋线对慢性萎缩性胃炎大鼠血清CRP、IL-6、TNF-α的影响（±s）

注:与空白组比较:##P<0.01,#P<0.05;与模型组比较:ΔP<0.05,ΔΔP<0.01。

组 别 例数 NCRP/（μ g/mL） IL-6/（pg/mL） TNF-α/（pg/mL）空白组 13 0.396 2±0.1005 13.9208±4.257 7 0.708 5±0.7819模型组 12 0.577 5±0.0951##47.439 2±25.8776## 4.110 8±3.2963#埋线组 12 0.411 7±0.0733ΔΔ 23.5325±6.709 8##Δ 1.5350±1.1776Δ

3 讨论

本研究通过复制大鼠慢性萎缩性胃炎模型,采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）,观察慢性萎缩性胃炎大鼠血清中CRP、IL-6、TNF-α的含量,并重点观察穴位埋线对其的影响。研究结果提示慢性萎缩性胃炎模型大鼠血清 CRP、IL-6、TNF-α与正常相比有所升高,而穴位埋线可使大鼠血清CRP、IL-6、TNF-α下降,穴位埋线对慢性萎缩性胃炎大鼠有明显的治疗作用。

C反应蛋白（CRP）是人类重要的急性反应蛋白,可在各种急慢性炎症、感染、发热、组织损伤、恶性肿瘤等疾病中增高,随着炎症的控制可恢复,检测CRP对于炎症性疾病的诊断、疗效观察有重要的临床意义,CRP的检测方法主要分为非标记技术和标记技术,本研究CRP主要采用标记技术中的ELISA测定法,检测敏感度较高。IL-6也属于炎症因子的一种,在炎症中有两方面的作用,一是保护作用,二是损伤作用,与多种疾病有关系,如感染性疾病,本研究中采用ELISA法进行检测。TNF-α是肿瘤坏死因子（TNF）的一种,适量的TNF-α可参与免疫细胞的活化炎症反应,具有抗感染、抗病毒和抗肿瘤作用;而过量的TNF-α则可导致细胞破坏,溶酶体漏出,炎性介质释放,使黏膜营养不良,加重黏膜炎症反应,甚至诱发机体产生恶质素,导致癌变可能,在本研究中同样采用ELISA法进行检测。CRP、IL-6、TNF-α均属于炎症因子,在炎症过程中起着重要的作用,慢性萎缩性胃炎有着胃黏膜的慢性炎症改变,同时也是胃癌癌前病变的类型,研究表明,在炎症过程中血清CRP、IL-6、TNF-α明显高于正常,证明慢性萎缩性胃炎大鼠有明显的炎症存在,而穴位埋线治疗对CAG大鼠炎症反应有明显抑制作用,抑制炎症反应可能有助于慢性萎缩性胃炎病情的改善。

本研究所选取大鼠穴位为足三里、中脘、脾俞,三者临床常用于治疗胃肠疾病。穴位埋线疗法近年来在临床中应用非常广泛,它属于针灸治疗方法的一种,其治病原理从中医学角度来讲是调节经络脏腑来治疗疾病,通过本研究表明其对慢性萎缩性胃炎治疗作用可能与抑制炎症反应相关。

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