乙肝后肝硬化证候特点的蛋白质组学研究*

周 迪，徐品初，刘新华，徐列明

(1.上海中医药大学附属曙光医院，上海 201203;2.上海中医药大学肝病研究所，上海 201203;3.肝肾疾病病证教育部重点实验室，上海 201203;4.国家中医药管理局慢性肝病虚损重点研究室，上海 201203;5.上海市中医临床重点实验室，上海 201203;6.上海中医药大学科技实验中心，上海 201203)

中医治病讲究辨证论治，通过分析疾病的症状、体征来推求病因，为治疗用药提供依据［1］。上海中医药大学肝病研究所提出肝硬化的基本病机是“正虚血瘀”，并提出“扶正化瘀”治法在临床取得显效［2］。课题组前期在基于“正虚血瘀”病机的乙肝后肝硬化中医证候特点的前瞻性研究中，将103例乙肝肝硬化证候归纳为脾气亏虚证候、肝肾阴虚证候和血瘀证候3类。我们进而结合纳米金属螯合(MB-IMAC Cu)磁珠纯化技术和MALDI-TOF-MS技术，利用质谱仪对103例乙肝后肝硬化患者、29例健康人群以及29例慢性乙型肝炎患者的血清标本进行检测比较，探讨肝硬化病程进展中及典型肝硬化中医证候群血清蛋白质组的差异。

1 对象与方法

1.1 对象

1.1.1 分组 肝硬化组:病例来源为2008年8月至2011年1月期间曙光医院肝硬化科住院部乙肝后肝硬化患者。参照2010年中华医学会肝病学分会、感染病学分会联合修订的肝硬化诊断标准［3］。同时参照国家技术监督局发布的《中医临床诊疗术语》所制定的中医辨证和疗效评定标准(试行方案)［4］，确定证候群的划分。正常组:来自于曙光医院护工管理处及保安部的职工。正常组无明显证候及慢性疾病史，相关实验室和影像学检查未见异常。慢乙肝组:来源于曙光医院肝硬化科住院患者。根据2010年《慢性乙型肝炎防治指南》中慢性乙型肝炎诊断标准［4］。

1.1.2 仪器和试剂 MALDI-TOF-MS基质辅助激光解吸离子飞行时间质谱仪(Autoflex)、磁珠分离 器 (magnetic bead separator，MBS)、MTPAnchorchip 800/384点样靶、α-氰基-4-羟基苯丙烯酸(HCCA)、纳米金属螯合磁珠 (MB-IMAC Cu)，结合缓冲液(Binding Solution)、清洗缓冲液(Washing Solution)、洗脱缓冲液(Eluting Solution)均为德国Bruker Daltonics公司产品。

1.2 方法

1.2.1 血清样本的收集 被检者空腹采血5ml，室温下静置 30min。3000 r/min离心 5min，收集上层血清，分装成100μl/管置于EP管中，－80℃冰箱保存。

1.2.2 纳米磁珠预处理 (1)混匀磁珠悬浮液(MB-IMAC Cu)1min，取出5μl加入200μl样品管中;(2)加入50μl结合缓冲液(BS)，反复抽吸20次与磁珠充分混匀;(3)将样品管放入磁珠分离器，反复移动样品管10次，并在磁珠分离器上停留20s，使磁珠富集于管壁，用移液器吸去样品管中的溶液。重复上述2～3步骤;(4)样品管中加入20 μl结合缓冲液(BS)使磁珠重新悬浮;(5)解冻血清，吸取5μl血清加入样品管内，反复抽吸使血清与磁珠充分混匀，室温放置5min;(6)将样品管放入磁珠分离器静置20sec，吸去磁珠旁的液体;(7)加入100 μl清洗缓冲液 (WS);(8)磁珠分离器前后相邻两孔间反复移动样品管10次，使样品管在磁珠分离器上静置20s，吸去悬浮的液体。重复上述7～8步骤;(9)加入10μl洗脱缓冲液(ES)，反复抽吸使之充分混匀，室温静置5min;(10)样品管放入磁珠分离器，磁珠贴壁20sec，用移液器将洗脱下来的样品溶液移入新的样品管，以备质谱分析操作。

1.2.3 点靶检测 取250μl ACN(乙腈)、2%TFA(三氟乙酸)250μl和 15mg HCCA(α-氰基-4-羟基肉桂酸)于EP管中，经超声波溶解形成饱和溶液，离心5min收集上清液作为基质。取2μl样品点靶于MTP-Anchorchip800/384点样靶上，并记录相应点的位置，待样品稍干时取2μl基质与样品充分混合，在室温下自然干燥后待检测。

1.2.4 质谱分析 用标准蛋白质校正仪器，使质荷比误差范围至0.1%内。Autoflex Control软件参数设置如下:靶MTP-Anchorchip800/384，激光能量在60%左右。选择方法 LP-Protmix.par，检测分子量范围为4000～20000Da、20000～1000000 Da;选择方法RP-Protemics-HPC.par，检测分子量范围为500～4000Da。每个样品打靶10次，每次射击100次进行加合。应用Autoflex Analysis软件对采集图谱进行分析。运用ClinProTools 2.1软件分析所获得的蛋白谱图找出差异蛋白，找出每组蛋白差异有统计学意义(P≤0.05)的质荷比峰。

1.2.5 统计学方法 选择软件中快速分类算法(Quick Classifier algorithm，QC)，将组内差异蛋白质波峰建立分类预测模型，初步建立慢乙肝、乙肝后肝硬化各中医证候群及各Child-Pugh分级与正常人群比较差异蛋白质的诊断模型。

2 结果

2.1 反应正常-慢乙肝-肝硬化过程中血清蛋白质组研究

肝硬化组与正常组比较，有53个血清蛋白质峰的差异表达有统计学意义(P≤0.05)，利用QC法比对出其中15个蛋白质峰可建立乙肝肝硬化的诊断模型，组内交叉验证显示模型的敏感性为95.15%，特异性为100.0%。

表1图1显示，肝硬化阶段蛋白质组的变化应当始于慢乙肝阶段。本文构成肝硬化诊断模型的15个蛋白质峰中，质荷比为4643.25和9289.47的蛋白质峰也是构成慢乙肝诊断模型的蛋白质峰，按正常组-慢乙肝组-肝硬化组顺序，这2个蛋白质峰有逐级下调的的变化趋势。

图1 乙肝、肝硬化与正常组差异蛋白质峰表达(m/z 9289.47)

表1 慢乙肝组、肝硬化组与正常组同质荷比的蛋白质峰比较(± s)

表1 慢乙肝组、肝硬化组与正常组同质荷比的蛋白质峰比较(± s)

质荷比m/z 正常组 慢乙肝组 肝硬化组4643.25 300.91±75.12 178.88±53.90 133.87±60.19 9289.47 1196.15±276.62 712.44±182.34 401.04±232.51

2.2 反映肝硬化中医证候血清蛋白质组研究

自制《肝硬化“虚损生积”中医病因学研究量表》，采集乙肝后肝硬化患者的症状及体征。参照国家技术监督局发布的《中医临床诊疗术语》所制定的中医辨证和疗效评定标准(试行方案)［5］，应用多元化分析技术，将肝硬化的中医证候分为脾气虚弱、肝肾阴虚和血瘀3个证候群(全文另发)。

表2显示，在慢乙肝和肝硬化患者血清中都有表达的质荷比为4643.25和9289.47的蛋白质峰，在肝硬化血瘀证候组、脾气虚弱证候组和肝肾阴虚证候组中都有下调表达，其中肝肾阴虚证候组的表达量最低。

表2 肝硬化各中医证候组与正常组蛋白质峰比较(±s)

表2 肝硬化各中医证候组与正常组蛋白质峰比较(±s)

质荷比m/z 正常组 脾气虚弱证候组 肝肾阴虚证候组 血瘀证候组4643.25 300.91± 75.12 160.40±88.10 109.73± 38.16 160.42±38.68 9289.47 1196.15±276.62 493.68±339.98 297.35±193.95 542.82±159.92

2.2.1 反应肝硬化脾气虚弱证候的血清蛋白质峰 图2、3显示，脾气虚弱证候组与正常组样品区分较明显，14个蛋白质差异峰组成肝硬化脾气虚弱证候组的诊断模型，其中9个蛋白质峰与肝硬化蛋白质诊断模型的蛋白质峰重叠，2401.04、5336.27和5818.54的蛋白质峰呈上调趋势，4643.14、6631.04、7765.28、7826.06、9289.09 和 49884.99 呈下调趋势。这14个蛋白质差异峰在Child-Pugh各级中都有表达，其中质荷比为7826.33蛋白质峰在Child-Pugh A级的诊断模型中，质荷比为5336.86和7765.28蛋白质峰可在Child-Pugh B级的诊断模型中找到，质荷比为 5818.54、7765.28、7826.06和12600.54的蛋白质峰也出现在Child-Pugh C级的诊断模型中;而质荷比为4643.14、7765.28和9289.09的蛋白质峰在Child-Pugh A、B、C级血清中均有表达。因此从蛋白质组学角度观察提示，脾气虚弱证候在乙肝肝硬化中是普遍存在的。

图2 肝硬化脾气虚弱证候组与正常组血清蛋白质差异

2.2.2 反应肝硬化肝肾阴虚证候的血清蛋白质峰 图4、5显示，肝硬化肝肾阴虚证候血清蛋白质诊断模型由4个蛋白质峰组成，其中质荷比为1021.39、4642.52和9288.2的蛋白质峰，包括在肝硬化血清蛋白质诊断模型的15个蛋白质峰中，均呈下调趋势。构成肝肾阴虚证候组诊断模型的4个蛋白质峰中，4642.52和9288.2在Child-Pugh A、B、C级患者血清中均有表达，1021.39与Child-Pugh B级诊断模型的蛋白质峰重叠，1264.73也存在于Child-Pugh C级诊断模型的蛋白质峰谱中。

2.2.3 反应肝硬化血瘀证候的血清蛋白质峰 图6、7显示，组成肝硬化血瘀证候血清蛋白质诊断模型的11个蛋白质峰中，有7个包括在肝硬化血清蛋白质诊断模型中，其中上调的蛋白质峰是4784.93 和5804.82，而 1207.69、4642.49、7763.89、7825.16和9287.21蛋白质峰则呈下调趋势。11个蛋白质峰中，4642.49、7763.89和9287.21存在于肝硬化Child-Pugh各分级血清蛋白质诊断模型中，7825.16存在于Child-Pugh A级血清蛋白质诊断模型中，1207.69也是Child-Pugh B级血清蛋白质诊断模型的蛋白质峰，1467.02、7825.16和12598.83在Child-Pugh C级血清蛋白质诊断模型中表达。

图3 构成肝硬化脾气虚弱证候诊断模型的平均蛋白质峰

图4 肝硬化肝肾阴虚证候组与正常组血清蛋白质差异分布

图5 构成肝硬化肝肾阴虚证候诊断模型的平均蛋白质峰

图6 肝硬化血瘀证候组与正常组血清蛋白质差异分布

2.3 差异蛋白质数据库搜索结果

分别对特征差异蛋白质进行数据库(http://expasy.org/tools/tagident.html)搜索，设置质荷比误差范围(Mw range)为0.1%，可得到与差异蛋白质荷比最为接近的蛋白质及多肽，以质荷比4642为例，数据库搜索可得16个蛋白质(搜索结果见表3)。

表3 差异蛋白质峰数据库搜索结果

3 讨论

肝硬化病位在肝，但“有诸形于内，必形于外”，肝硬化的病变可以在肝外有所表现。本文发现，质荷比为4643.25和9289.47的蛋白质峰按正常组-慢乙肝组-肝硬化组顺序，有逐级下调的的变化趋势。显然这2个蛋白质峰与疾病的进展呈反比关系，而与肝脏纤维组织蛋白的直接关系不大。这一结果提示，血清蛋白质组能够反映疾病的不同阶段，有助于辅助鉴别诊断肝硬化和肝纤维化。这项工作还需将来开展前瞻性的大样本研究加以证实。

血清蛋白质组学也有助于中医证候的研究。本文中肝硬化以脾气虚弱证候、肝肾阴虚证候或血瘀证候为主的患者，其血清蛋白质组都有特征性的表达。肝硬化脾气虚弱证候群的血清蛋白质诊断模型由14个蛋白质差异峰组成，肝硬化肝肾阴虚证候群的血清蛋白质诊断模型由4个蛋白质峰组成，肝硬化血瘀证候群的血清蛋白质诊断模型由11个蛋白质峰组成。虽然可能对肝硬化有诊断价值的4643.25和9289.47的蛋白质峰在3个证候群的血清蛋白质诊断模型中都出现，脾气虚弱证候群和血瘀证候群的血清蛋白质诊断模型还共有3个蛋白质峰，但是总体上3种证候群在血清蛋白质组中可以区分。将来能否应用以上血清蛋白质诊断模型来辅助辨证，这还需更大样本的验证和确定标准，无论如何辨证主要还是靠四诊。

图7 血瘀证候组与正常组平均蛋白质峰诊断模型的差异峰

本文研究的目的，是利用血清蛋白质组学开展肝硬化中医病机的研究。我们根据《证治汇补·积聚》的“壮实人无积，虚人则有之”论述，提出肝硬化的中医基本病机是“正虚血瘀”［5］，“正虚”和“血瘀”在肝硬化全程甚至在肝纤维化阶段均已存在的观点得到业界支持［6］。本文的结果为我们观点提供了新的证据。代表脾气虚弱、肝肾阴虚和血瘀证候的血清蛋白质峰在肝硬化Child-Pugh各分级都有表达，结合另文发表的这些患者的3种证候在Child-Pugh各分级的表现，“正虚血瘀”肝硬化病机是成立的，多年临床治疗证实扶正化瘀治则也是有效的［7］。然而有关“正虚”的提法过于笼统，究竟正气哪部分发生虚损?按照张景岳“阳化气，阴成形”的理论，“凡虚损……或先伤其气，气伤必及于精;或先伤其精，精伤必及于气。但精气在人，无非谓之阴分。盖阴为天一之根，形质之祖，故凡损在形质者，总曰阴虚，此大目也”(《景岳全书·杂证谟·虚损》)，我们的研究进一步提出“虚损生积”的病机理论，认为虚损可以导致精伤阴虚，脾气虚弱和肝肾阴虚是肝硬化“正虚”的具体表现［8］。本文的研究结果为上述观点提供了客观依据。

一般认为，肝肾阴虚是肝硬化(积)晚期出现的证型，出现肝肾阴虚预示病情已经危笃。本文结果显示，肝肾阴虚证候的血清蛋白质诊断模型中4个蛋白质峰各有3个在Child-Pugh B级和C级表达，也显示肝肾阴虚证候是存在于乙肝肝硬化中晚期的依据。但是质荷比为4642.52和9288.2的蛋白质峰也在Child-Pugh A级患者血清中出现，结合临床的四诊信息，提示在肝硬化的早期，肝肾阴虚证候虽不典型但已有表现。因此临床治疗肝硬化，有必要未雨绸缪，注意顾护肝肾阴精。失代偿期肝硬化患者滋养肝肾的治法不可忽视，代偿期肝硬化治疗时也应兼顾补益肝肾。

一级质谱血清蛋白质组学能反映某证候的血清蛋白指纹图谱特征，以此特征作为临床证候的客观辨别，及辨证施治的疗效评估。由一级质谱获得血清蛋白组学图谱，诸成分质荷比(m/z)通过数据库搜索，可获得多种同m/z值异分子量物质。表3显示，质荷比为4642的蛋白质峰在误差范围0.1%可搜索到16个差异蛋白质。因此，进一步的研究，需要在弄清各特征性表达的血清蛋白质峰具体是哪种蛋白质的基础上，更为精确的识别差异蛋白属性，需进行蛋白的肽链氨基酸序列和结构分析。通过“认识世界”和“改造世界”，阐释肝硬化血清蛋白质组学的临床意义。

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