金柑抗冻实验模型的建立

2013-10-09饶力群李梦芸马珊珊

湖南农业科学 2013年19期

郭纯，杨华，饶力群，李梦芸，马珊珊

（1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南长沙 410007；2.湖南农业大学生物科学技术学院，湖南长沙 410128；3.湖南洞庭药业股份有限公司，湖南常德 415001）

冻害是农业气象灾害的一种。常发生的有越冬作物冻害、果树冻害和经济林木冻害等[1-3]。冻害对农业威胁很大，如美国的柑橘生产、中国的冬小麦和柑橘生产常因冻害而遭受巨大损失。历史上，我国长江流域、美国柑橘产区就因严重的周期性冻害数次遭受严重打击。自1949年以来，我国出现了5次柑橘大冻害（1955年，1969年，1977年，1992年和2008年），仅1992年1月的冻害使我国柑橘受冻面积达56万hm2，产量损失超过200万t；2008年1～2月的冰冻对几个主要产区均造成严重影响，特别是湖南、湖北等地更为严重。湖北的三峡库区、丹江库区、富水库区等柑橘集中产区75%以上的柑橘受到不同程度的冻害，其中有25%的柑橘受到毁灭性损害。湘西的柑橘产业也遭到了毁灭性打击，受灾面积达6.67万hm2，成灾4.73万hm2，绝收近1.93万hm2，直接经济损失约7亿元。面对如此频繁的灾害影响，研究柑橘抗冻的机制显得十分必要，而建立柑橘抗冻试验模型则是研究柑橘抗冻机制的前提条件。试验采用冷驯化诱发抗寒能力的金柑为实验组[4]，以未冷驯化诱发抗寒能力的金柑为对照组，模拟柑橘越冬时气温低、土温高的环境[5-6]，摸索金柑能耐受的最低温度和低温持续时间，以建立金柑抗冻实验模型。

1 材料与方法

1.1 试验材料

挑选生长健壮、粗细较一致的2 a生金柑（Fortunella margarita(Lour.)Swingle）苗 200株，用钵高24 cm、钵开口直径为24 cm规格的营养钵栽植，营养土为菜园土掺1/3的火土灰，采用一般的肥水管理和病虫害防治。所有材料放置室温28℃（室内温度变动26.5℃～29.5℃。）正常生长1个月后，随机选取100株移入控温室内进行冷驯化，温度设定为4℃，室内温度为3.5～6.0℃，时间15 d。

1.2 低温处理

试验材料在冷驯化半个月后，每3株用棉絮包裹营养袋及根颈，放入试验改装的控温箱进行低温处理。控温箱温度在0～-20℃（温度变化控制在±0.2℃）。以未冷驯化的金柑经过不同时间不同温度的低温处理后作为对照，取样进行生理生化分析，单株设3次重复。

1.3 细胞损伤分析

金柑受冻的叶片表现为水渍状、透明，颜色加深呈墨绿色，质感变薄，叶片上的细小白点消失，数小时后逐渐卷曲，2~3 d后叶片干枯。以成熟叶片是否冻死（处理后叶片卷曲、干枯）为标准，配合电解质渗出率及丙二醛（MDA）含量的测定，找到金柑在试验条件下所能耐受的最低温度及能耐受低温的持续时间。

1.3.1 电解质渗出率的测定经低温处理的材料分别放入20 mL具塞刻度试管中，准确加入去离子水20 mL，盖上试管塞，在控温室浸泡24 h，每次浸泡时保持环境温度基本一致，搅动混匀后用精密电导率仪（DDS-312型，上海大普仪器有限公司）测定溶液电导率，冷驯化处理样品的电导率为E1，对照材料的电导率为E0。冷驯化处理的样品再放入98±2℃沸水浴中1 h，以杀死植物组织，取出置控温室冷却至室温，测其煮沸电导率E2，按下式计算各处理的电解质渗出率：电解质渗出率（%）=[（E1-E0）/（E2-E0）]×100%。

1.3.2 丙二醛（MD A）含量的测定取待测液1.0 mL，加入 5.0 mL 20%的三氯乙酸（TCA）（含 0.5%的硫代巴比妥酸：TBA）混匀后塞上塞子，水浴煮沸30 min，冰浴快速冷却，4 000 r/min 离心 10 min，以20%TCA为参照，上清液用紫外分光光度计测定532 nm和600 nm处的吸光值A532和A600，重复3次求平均值，MDA含量=△A×N/W。△A=A532-A600，N为稀释倍数，W为植物样品重量（g）。

2 结果与分析

2.1 实验模型的冰冻处理时间

为了探讨金柑生长期所能耐受的冰冻低温持续时间，两种处理的盆栽苗用棉絮包蔸，在-6℃下处理不同时间，观察叶片受冻情况。两种处理的盆栽苗冰冻30 min均未表现出冻害症状；未经冷驯化的金柑冰冻40 min出现冻害症状，60 min其大多数叶片受冻；而经冷驯化的金柑冰冻50 min才出现冻害症状，60 min只是轻微的冻害（表1）。为减少控温箱中缺乏光照的影响，并鉴于上述结果，选定抗冻实验模型的冰冻处理时间为60 min。

表1 -6℃下不同时间处理金柑叶片受冻情况

2.2 实验模型的冰冻处理温度

为了探讨金柑生长期所能耐受的致死温度，两种处理的盆栽苗用棉絮包蔸，在不同温度下冰冻处理60 min，观察叶片受冻情况。两种处理的盆栽苗0℃下均未表现出冻害症状；未经冷驯化的金柑-3℃出现冻害症状、-6℃大多数叶片受冻、-12℃全部叶片受冻；而经冷驯化的金柑-6℃才出现轻微的冻害症状、-12℃大多数叶片受冻（表2）。考虑到抗冻实验模型中未经冷驯化的对照组要求表现受冻，而经冷驯化的处理组不能表现受冻，因此抗冻实验模型的冰冻温度需要选定在-9～-12℃。

2.3 低温胁迫对金柑叶片电解质渗出率的影响

表2 不同低温处理60 min金柑叶片受冻情况

两种预处理的金柑在温度高于-6℃条件下冰冻60 min，其叶片电解质渗出率均低于50%；但未经过冷驯化的金柑在-9℃条件下冰冻处理，其叶片电解质渗出率增加到58.4%，当温度下降到-12℃时，电解质渗出率陡然增加到96.2%，表现为所有叶片均严重受损；而经过冷驯化的金柑叶片电解质渗出率在-9℃条件下依然低于50%，当温度下降到-12℃时，电解质渗出率平缓地增加到51.4%，表现为部分叶片受损（图1）。将温度-电解质渗出率拟合Logistic方程[7-8]，可以求出半致死温度。实验结果表明经冷驯化的金柑的半致死温度低于-10℃。当温度处于-10℃时，未经冷驯化的对照组受冻60 min，其叶片的电解质渗出率远大于50%，表现出严重的冻害，可以作为抗冻实验模型的对照组；当温度处于-10℃时，经冷驯化的实验组受冻60 min，其叶片的电解质渗出率低于50%，不会表现出严重的冻害，可以作为抗冻实验模型的实验组。

2.4 低温胁迫对金柑叶片中丙二醛（MDA）含量的影响

MDA是膜质受氧自由基破坏的产物，是膜损伤的重要指示指标。随着温度的降低，冻害加深，MDA含量也逐步增加。到-9℃时处理60 min出现峰值，但到-12℃时MDA含量反而急剧降低。对照组在-12℃时处理60 min的MDA含量较-9℃时处理60 min的MDA含量下降了0.062 6，处理组下降了 0.084 6（图 2）。

2.5 抗冻实验模型的检验

图2 不同冰冻温度处理下金柑叶片MDA含量的变化

根据对不同温度和不同处理时间的研究，选定处理温度为-9～-12℃之间，处理时间为60 min。再通过考察金柑叶片电解质渗出率和MDA含量，选定处理温度为-10℃。对照组和冷驯化组金柑经过-10℃条件下冰冻60 min处理，结果如图3。研究结果表明：未经冷驯化的对照组在-10℃条件下冰冻60 min后受到严重冻伤。叶片表现为水渍状、透明，颜色加深呈墨绿色，质感变薄，叶片上的细小白点消失，1 h后逐渐卷曲，2~3 d干枯，树枝变软、下垂，逐步变黄，数日后干枯，最后整株死亡；经过冷驯化的处理组在-10℃条件下冰冻60 min后受到一定的冻害。叶片呈轻微水渍状，颜色加深呈浅绿色，叶片上的部分细小白点消失，少部分嫩叶微卷曲；嫩枝变软，叶片下垂；经过28℃恢复1星期，叶色变浅，叶片背面呈白色，细小白点重新出现，嫩枝变硬，叶片抬升；并有少数腋芽萌动。由此表明：在-10℃条件下冰冻60 min，对照组受到严重冻害，而处理组只有轻微冻害并能得到恢复。因此，-10℃可以作为抗冻实验模型的处理温度。

图3 -10℃条件下60 min冰冻处理金柑叶片受冻情况

3 讨论

3.1 材料的选择

柑橘的耐寒性与柑橘品种密切相关，柑橘品种的耐寒能力依次为：枳>金柑>阔皮柑橘>酸橙>甜橙>柚类>柠檬、枸橼[9-10]。枳耐寒能力最强，但枳到冬天叶片会脱落，无法用其叶片开展抗冻研究[11]。金柑，又名金桔，属芸香科，是著名的观果植物。金柑虽然抗寒能力弱于枳，但其属常绿植物，而且叶形较大，取材方便，是开展柑橘抗冻研究的理想材料。