超高效液相色谱－串联质谱法测定鸡肉和牛肉中五种常用抗球虫药

李 丹，孙 雷，毕言锋，徐 倩，王鹤佳，徐士新

(中国兽医药品监察所 国家兽药残留基准实验室，北京 100081)

球虫病是由一种单细胞原虫进入肠道而引起的一类流行病，在畜禽球虫病中，以鸡、兔、牛和羊的球虫病危害最大［1］。氯苯胍、常山酮、氯羟吡啶、氨丙啉均属于化学合成类抗球虫药物(结构式见图1)，乙氧酰胺苯甲酯属于抗球虫药增效剂，与多种抗球虫药联合使用，这五种药物对于多种球虫病均有良好的治疗效果。由于不规范使用，抗球虫药若长期、持续添加在饲料中，极容易造成药物在肉及蛋品中出现残留，危害人体健康。我国农业部235号公告中严格规定此五种抗球虫药在牛、鸡肌肉中的最高残留限量范围为10～500μg/kg。文献中，采用HPLC及LC－MS/MS测定动物性组织中氨丙啉、常山酮、氯苯胍等单一药物的报道较多，但对动物性组织中氨丙啉、氯羟吡啶、乙氧酰胺苯甲酯、常山酮和氯苯胍五种药物同时检测的残留检测方法报道文献较少。本研究拟采用LC－MS/MS方法建立鸡、牛肌肉中氨丙啉、氯羟吡啶、乙氧酰胺苯甲酯、常山酮和氯苯胍五种药物的多残留检测方法，以期为该类药物的残留监控提供科学依据。

图1 氨丙啉、氯羟吡啶、乙氧酰胺苯甲酯、常山酮和氯苯胍的化学结构式

1 材料与方法

1．1 仪器 ACQUITY UPLC－Quattro Premier XETM质谱联用仪，Waters公司;AE260电子天平，Mettler Toledo公司;Biofuge Strators高速冷冻离心机，贺利氏公司;Organomation Associates氮吹仪，Jnc公司;SIR4漩涡混合器，IKA公司。

1．2 试剂与材料 对照品:氨丙啉、氯羟吡啶、乙氧酰胺苯甲酯、常山酮和氯苯胍，纯度均大于95．0%，Dr．Ehrenstorfer EmbH 公司;乙腈、甲醇为色谱纯，Fisher公司;乙酸铵为分析纯;正己烷为分析纯;所用水为超纯水。

1．3 标准储备液和工作液的配制 称取氨丙啉、氯羟吡啶、乙氧酰胺苯甲酯、常山酮和氯苯胍对照品适量，精密称定，分别置于10 mL棕色量瓶中，甲醇溶解并稀释成浓度为1 mg/mL的标准储备液;分别精密量取五种标准储备液适量，置同一10 mL棕色量瓶中，用甲醇逐步稀释成适宜浓度的混合标准工作液。

1．4 标准曲线绘制 精密量取适量混合标准工作液，用 50% 甲醇稀释成浓度均为 10、50、100、200、500 ng/mL的系列混合对照溶液，量取5种浓度的混合对照溶液各1．0mL，分别用于溶解预先按提取净化吹干后的残留物，按照样品前处理方法处理后作为基质匹配系列混合对照溶液，从低浓度到高浓度测定，每一浓度进样3针，以特征离子质量色谱峰面积为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。

1．5 UPLC－MS/MS分析条件 色谱条件:色谱柱为 BEH C18色谱柱(50 mm ×2．1 mm，1．7 μm);流动相A相为乙腈，B相为20 mmol/L乙酸铵水溶液，梯度洗脱:0～4 min，5%A线性变化至100%A;4～5 min，100%A 线性变化至 5%A;5～6．5 min，维持5%A。流速0．3 mL/min，柱温30℃，进样量10 μL。

质谱条件:电喷雾离子源(ESI+)，毛细管电压为3．2 kV，萃取电压为3V，RF透镜电压为1V，源温110℃，脱溶剂温度350℃，脱溶剂气速650 L/h，锥孔反吹气速50 L/h。多反应监测各药物离子对及对应的锥孔电压、碰撞能量见表1。

表1 5种药物的定性、定量离子对、锥孔电压和碰撞能量

1．6 样品前处理 准确称取绞碎后的(2±0．05)g试料，置于50mL离心管内，加乙腈8mL，涡旋混合30 s，中速振荡5 min，8000 r/min离心5 min后，上清液置于另一50 mL离心管内，残渣重复提取一次。合并两次上清液，混匀后取出8 mL置于玻璃管中，于50℃水浴中氮气吹干。残余物用50%甲醇水溶液1．0 mL溶解，再加50%甲醇水溶液饱和的正己烷1．0 mL，涡旋混合30 s，静置分层后，转移下层溶液至1．5 mL塑料离心管内，于 －4℃下13000 r/min离心10min后，吸适量下层溶液过0．2 μm滤膜后，供液相色谱－串联质谱仪分析。

1．7 方法学考察

1．7．1 方法灵敏度确定 将适量混合标准溶液加入到空白组织中，经上述方法进行前处理后，用UPLC－MS/MS检测，观察药物特征离子质量色谱峰信噪比(S/N)和对应药物浓度，S/N＞3，定为方法的检测限;S/N＞10，定为方法的定量限。

1．7．2 准确度和精密度的测定 采用标准添加法，在空白组织中添加低、中、高三个不同浓度混合组分进行回收率试验;各浓度进行6个样品平行试验，重复3次，求批内、批间RSD。

2 结果与讨论

2．1 流动相的选择 本研究通过优化流动相改善五种药物的分离效果。分别试验了甲醇－0．1%甲酸水溶液、乙腈－0．1%甲酸水溶液、0．1%甲酸乙腈－0．1%甲酸水溶液、乙腈－20 mmol/L乙酸铵水溶液作为流动相，结果表明，含有乙腈的流动相均优于含有甲醇的流动相，流动相中加入乙酸铵后，分离效果更好。因此，本方法以乙腈－20 mmol/L乙酸铵水溶液为流动相进行梯度洗脱。

图2 空白牛肌肉特征离子质量色谱图

2．2 前处理条件的优化 氨丙啉、氯羟吡啶、乙氧酰胺苯甲酯、常山酮和氯苯胍五种抗球虫药均属于弱碱性化合物，易溶于酸性水溶液和极性有机溶剂。已报道的提取用溶剂有乙酸乙酯［2］、磷酸盐缓冲液［3］、乙腈等;用液液萃取、固相萃取等方法净化，用到的固相萃取柱有 HLB柱［4－5］、碱性氧化铝柱［6－7］等。经过优化处理，本方法采用乙腈进行提取，再用正己烷去除脂肪等杂质，使得这五种药物获得较高的回收率，且前处理过程简单，省去了采用固相萃取柱净化的步骤。

2．3 方法线性 5种药物混合标准工作液在10～500μg/L的系列基质校准标准溶液范围内，呈良好线性关系，标准曲线及相关系数见表2。

表2 5种药物的标准曲线及相关系数

2．4 方法灵敏度、回收率和精密度 采用空白组织中添加目标化合物的方法，得出5种药物在样品中的检测限均为5μg/kg，定量限均为10μg/kg。牛肌肉基质空白色谱图见图2，100μg/kg空白牛肉基质匹配试液和100μg/kg空白牛肉添加试液中5种药物的特征离子质量色谱图见图3、图4。

图3 100μg/kg空白牛肌肉基质匹配试液中五种药物的特征离子质量色谱图

图4 100μg/kg空白牛肌肉添加试液中5种药物的特征离子质量色谱图

在空白牛、鸡肌肉中添加100、200、500μg/kg三个不同浓度的5种混合组分进行回收率试验，结果汇总见表3。可以看出，5种药物在空白牛、鸡肌肉中的平均添加回收率为75．4% ～109%，批内批间相对标准偏差均小于15%。

3 结论

本研究利用超高效液相色谱－串联质谱法(UPLC－MS/MS)同时测定鸡肉和牛肉中5种常用抗球虫药物，方法线性、灵敏度、回收率和精密度等参数均能满足兽药残留分析方面的要求。

表3 空白牛肉、鸡肉中添加5种抗球虫药的回收率和精密度实验结果

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