ELISA试剂盒用于检测猪尿中赛庚啶残留的考察

张 鑫，吴剑平，顾 欣，李丹妮，严 凤

(上海市兽药饲料检测所，上海 201103)

赛庚啶(Cyproheptadine，CYP)是一种人用药，在临床上用于治疗过敏反应导致的皮炎等疾病，由于该药具有可抑制下丘脑的饱觉中枢而刺激食欲的作用［1－2］，可以促进动物生长。2010 年，上海市兽药饲料检测所首次发现CYP被一些不法畜牧养殖企业作为新型养殖促进剂非法使用，而CYP在畜产品中的残留对消费者的健康极有危害。2010年底，中国农业部第1519号公告《禁止在饲料和动物饮水中使用的物质》明确禁止使用该类药物作为家畜的生产促进剂，2012年，上海市和江苏省率先开展了地产生猪出栏前CYP监测。

动物口服CYP后40%以上由尿液排泄，主要为原形药物及葡萄糖醛酸结合的季铵盐型CYP，不同动物的尿液中代谢物成分含量有所不同。可通过检测猪尿中的CYP残留以监控其在养殖业的非法使用。当前用作CYP残留检测的仪器方法为HPLC 或 LC/MS/MS 法［3－5］，检测对象为接受 CPY治疗的人或动物的血、尿或奶，最低检测限为0．1μg/L。但其前处理步骤复杂，成本较高，不适于日常监测及大规模筛查。

ELISA试剂盒可经济、快速地检测尿中的药物残留，但目前市场上可采购的CYP检测ELISA试剂盒均未标明适合检测猪尿样品。进口试剂盒(代号分别为A、B、C)在国外用于检测人或马用药后的CYP含量情况，国产试剂盒(D)是由进口抗体在国内分装生产，未明确说明适用于猪尿检测，因此，四种试剂盒用于猪尿的检测限与标示可能不符。试验通过考察四种试剂盒的反应原理、可操作性、灵敏度、检测限、回收率等，了解国内市场上CYP试剂盒的质量现状，探讨使用ELISA试剂盒监测猪尿中CYP残留的可行性，给出参考的检测限。由于国内猪尿中CYP残留检测工作刚刚起步，检测标准尚未出台，因此，本试验为CYP监测工作提供一定的试验依据。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 主要仪器及试剂 高速离心机，型号Sigma 1－14;酶标仪，型号BioTek ELX808。CYP试剂盒A、B、C、D，市售购得。CYP标准品，纯度98%，购自美国sigma公司。

1．1．2 试料 猪尿20份，采自上海市青浦区三家猪场。

1．2 试验方法

1．2．1 试样的制备 空白样品 20份猪尿阴性样品经LC/MS/MS法确证为CYP阴性样品。

空白添加样品 取阴性猪尿样品，添加CYP标准品储备液制成浓度为 0．1、0．5、1．0 和 5．0 μg/L的阳性样品各6份。

将空白及空白添加的猪尿液8000 r/min离心5 min，并根据各试剂盒对样品的要求进行稀释或直接测试。

1．2．2 试剂盒反应原理 吸附在孔内的抗原和标准品或样品中赛庚啶与特异性抗体竞争结合，与标品或样品中赛庚啶相结合的抗体被洗涤去除后，孔内抗原结合的抗体与酶标记的第二抗体相结合，酶底物在酶作用下显色，在450 nm下吸光度的高低与样品中赛庚啶的含量成反比。

1．2．3 试剂盒操作步骤 四种试剂盒的反应原理基本一致，操作步骤及反应时间有细微差异，仅把有区别的步骤列表如下。试剂盒的反应时间通常在75～100 min之间。

表1 四种试剂盒的操作步骤及反应时间差异比较

1．2．4 灵敏度、检测限、准确度 试剂盒的灵敏度由50%抑制浓度(IC50)体现。测定5次标准曲线，计算出每条标准曲线的IC50。测定20份阴性尿液样品，根据标准曲线求出CYP的测定值，计算平均值和标准差。检测限为平均值加3倍标准差，计算出猪尿中CYP的检测限。准确度以回收率表示。取CYP空白添加猪尿样本，每个浓度做6次平行检测，计算猪尿中CYP的平均回收率。

1．2．5 与不同分析方法的比较 参照文献［4］提供的HPLC/MS/MS法对空白及阳性添加猪尿进行检测，与试剂盒检测结果做比较。

2 结果

2．1 50%抑制浓度(IC50) 四种试剂盒IC50的差异较大，范围为0．119 ～0．965 μg/L，结果见表2:

表2 四种试剂盒的IC50 μg/L

2．2 检测限 20份空白猪尿中CYP的测定均值及试剂盒的检测限见表3，试剂盒C与标示不符。

表3 猪尿中CYP检测限与定量限 μg/L

2．3 准确度 猪尿中CYP的四个添加浓度(0．1、0．5、1．0 和 5．0 μg/L)的检测准确度见表 4。

表4 CYP阳性质控猪尿样品检测准确度 (n=6)

2．4 与仪器方法的比较 LC/MS/MS法检测CYP浓度为0．1、0．5 和1．0 μg/L 的阳性添加猪尿样品的结果与试剂盒测试值的比较见表5。

表5 阳性添加猪尿样品中CYP的测试值

3 讨论

3．1 由于是ELISA半定量试剂盒，定量通常不够准确，在CYP添加浓度较低时，其回收率更多反映的是试剂盒本身的抗干扰能力及灵敏度。试剂盒A、B的灵敏度较高，IC50＜0．5μg/L，抗体特异性较好。数据显示，试剂盒A、B、D的检测限均低于0．5μg/L，可考虑该法的检测限定为0．5μg/L，同时为排除假阳性，含量在检测限以上的样品应由LC/MS/MS定性及定量。

试剂盒A、D在检测CYP添加浓度≥0．5μg/L的样品时有较稳定的回收率。试剂盒B检测限＜0．5μg/L，但回收率偏高。试剂盒C检测限及回收率均不能达到要求，不适于猪尿中赛庚啶的检测。3．2 研究数据显示，在日常监测中使用的大部分市售的ELISA试剂盒可以满足CYP筛查需要，但仍有以下问题需要注意:

选用试剂盒之前应对其性能参数进行全面的考察。例如，实验得到的检测限与商品标示的检测限可能并不相符。进口试剂盒在国外用于马、狗、人等用药后尿液及血液的检测，其检测限很可能不适合CYP非法添加饲喂监测的需要，需注意甄别。

通过考察了解试剂盒的特点，在批量检测样品时为结果判断提供依据。例如，试剂盒A的IC50和检测限都很低，回收率稳定，在较低浓度范围内有较好的线性，试剂盒B检测限较低，回收率却偏高，这对定量不利，却对定性有帮助，试剂盒D的IC50和检测限都较高，但在较高浓度范围内有较好的线性，因此不同试剂盒之间可以互补，在实际监测工作中应至少配备两个品牌以上的试剂盒交替使用。

由于不同物种尿液中CYP及其代谢物的含量不同，本文使用标准品添加实验对试剂盒进行评价有一定局限性，动物实验得出的结论可能不同。由于ELISA方法的局限性，仍存在基质干扰或假阳性的可能，所以对CYP含量大于0．5μg/L的样品需进行LC/MS/MS法确证实验。

［1］ Maria Konstandi，Anastasia Dellia － Sfikaki，Denis Varonos．Effect of cyproheptadine hydrochloride on ingestive behaviors［J］．Pharmacological Research，1996，33:1．

［2］ Masahiro Iwaki，Taro Ogiso，Yoshiaki Fujii．Pharmacokinetics of cyproheptadine and itsmetabolites in rats［J］．Bioi．Pharm．Bull．1993，16:12．

［3］ Gustavo Duarte Mendes，AndréArruda，Lu Shi Chen．Quantification of cyproheptadine in human plasma by high－performance liquid chromatography coupled to electrospray tandem mass spectrometry in a bioequivalence study［J］．Biomed．Chromatogr．2012，26:129 －136．

［4］ Cristina A．Fente，Patricia Regal，Beatriz I，et al．Developmentand validation of an LC－MS/MS confirmatory method for residue analysis of cyproheptadine in urine of food－producing animals［J］．J．Agric．Food Chem．2009，57:2595 －2598．

［5］ John E．Koundourellis，Kenneth O．Ebete，Eleftheria T，et al．Liq．isocratic high performance liquid chromatographic method for thequantitation of cyproheptadine in humanmilk and plasma using solvent and solid phase extraction techniques［J］．Chrom．＆ Rel．Technol．1999，22(4):603 －614．