银杏叶提取物对糖尿病大鼠心肌保护作用的研究

王春艳 田晶

吉林医药学院基础医学院生理学教研室,吉林 吉林 132013

1. 材料与方法

1.1 实验动物 体重180-220g的Wistar大鼠40只。

1.2 主要仪器与试剂

全自动生化分析仪；PCR反应仪；DAB显色试剂盒；UltraSensitiveTM S-P超敏试剂盒；一抗(兔抗鼠，结缔组织生长因子)；链脲佐菌素（STZ）；银杏叶提取物注射液。

1.3 分组、模型制备及给药 40只Wistar大鼠适应性喂养1w，1w后大鼠随机分为3组：正常组10只，模型组15只，治疗组15只。按STZ 50mg/kg体重，一次性腹腔注射。7d后，大鼠表现为多饮、多食、多尿和体重减轻，连续两次测定空腹血糖≥11.1mmol/L,非空腹血糖≥16.7 mmol/L，尿糖3+以上者列入糖尿病模型。造模过程中，正常组无死亡，模型组和治疗组分别死亡3只和2只，原因可能是低血糖等。模型组和治疗组各挑选一般状态较好的10只继续实验。正常组、模型组经胃给予生理盐水2ml/kg，治疗组经胃给予银杏叶提取物注射液4mg/kg，1次/日，持续12w。

1.4 方法

12w末大鼠断头，取血，全自动生化分析仪测定各组大鼠血糖(BG)、总胆固醇（TC）、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)。剖杀大鼠，剪取左心室心尖处心肌组织，浸于4%多聚甲醛中固定，进行常规石蜡包埋切片，免疫组化方法观察心肌组织中CTGF的表达，棕黄色颗粒产物为阳性标记。将剩余新鲜心肌组织保存于低温冰箱，采用RT-PCR法检测CTGF- mRNA的表达。

2. 统计学分析

所有数据用SPSS18.0统计软件包进行分析。计量资料以 ±s表示，进行方差分析，P<0.05为有显著性差异。

3. 结果

3.1 模型组与正常组相比，模型组BG、TC、TG、LDL均明显升高，HDL明显降低（P<0.05），差异有统计学意义。治疗组与模型组相比，各项指标均有改善，BG、TC、TG、LDL下降，HDL有所升高（P<0.05），差异有统计学意义。治疗组与正常组比较，BG、TC、TG、LDL等生化指标仍略高于正常组，HDL仍比正常组低（表1）。

表1 银杏叶提取物对大鼠血液生化指标的影响（±s）

表1 银杏叶提取物对大鼠血液生化指标的影响（±s）

注：与正常组比较,#:P<0.05；与模型组比较,*:P<0.05

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3.2 正常组心肌细胞内可见少量分布均匀的棕黄色颗粒(图1-A)。模型组心肌细胞膜和胞浆内均可见浓密的深棕黄色颗粒，CTGF的表达显著升高(图1-B)。与模型组比较，治疗组心肌细胞CTGF的表达明显降低，但仍略高于正常组(图1-C)。

图1 各组大鼠心肌组织免疫组化染色（400×）

3.3 与正常组比较,模型组心肌组织CTGFmRNA表达明显增高（P<0.05）,差异有统计学意义。与模型组相比,治疗组心肌组织CTGFmRNA表达明显降低(P<0.05),差异有统计学意义。（表2，图2，图3）。

图2 各组大鼠心肌组织中CTGF的RT-PCR电泳图

表2 各组心肌组织中CTGFmRNA表达水平的比较（±s）

表2 各组心肌组织中CTGFmRNA表达水平的比较（±s）

注：与正常组比较,#:P<0.05；与模型组比较,*:P<0.05；

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图3 各组大鼠心肌组织中CTGF mRNA表达水平比较

4. 讨论

糖尿病诱发的高血糖和高血脂状态可以破坏心肌细胞功能。Ren J等人[1]将正常大鼠的心肌细胞浸于高糖培养液中，24h即发现心肌细胞功能受损。脂肪代谢障碍会使血浆中脂类物质含量增加，血液黏稠度增加，脂类物质还会粘附在血管内皮细胞上，最终导致动脉粥样硬化、心脑血管疾病的发生。本实验中，造模组大鼠BG、TC、TG、LDL明显升高，而HDL明显降低。治疗组BG、TC、TG、LDL降低，HDL升高。结果提示，银杏叶提取物可以降低血糖、血脂，改善糖、脂代谢，减轻高血糖，高血脂对心肌细胞的破坏，对心肌具有一定的保护作用。

CTGF属于即刻早期基因CCN基因家族和胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白超家族，是一种具有促进细胞增殖，细胞外基质（ECM）合成，细胞黏附分子表达等多种生物活性的细胞因子。CTGF是TGF-β的一种下游元件，在结缔组织形成过程中，TGF-β诱导CTGF的表达，CTGF的表达又进一步介导TGF-β的部分生物作用。TGF-β可诱导心肌成纤维细胞、表皮成纤维细胞分泌CTGF，而CTGF又作用于相关细胞，参与TGF-β对这些细胞的促增生和促ECM合成。CTGF在正常生理状态下少量表达，且主要表达于间质细胞中[2]。本实验中发现，糖尿病大鼠心肌组织中CTGF基因及蛋白均呈强阳性表达。

综上所述，在糖尿病动物模型中CTGF呈现高表达状态，其中高血糖状态和TGF-β是诱导CTGF基因高表达的重要因素。CTGF对细胞增殖和基质积聚具有特殊生物学活性。在本实验中发现，银杏叶提取物可以降低糖尿病大鼠心肌细胞CTGFmRNA及蛋白的表达，减弱TGF-β诱导组织纤维化的效应，抑制心肌纤维化，提高心室顺应性，改善心肌细胞舒缩功能，延缓充血性心力衰竭的发生，对糖尿病心肌具有一定的保护作用，为糖尿病性心肌损伤的抗纤维治疗提供了更特异的药物作用靶点。

[1]Ren J,Gantant GA,Miller RE.et al. High extracelluar glueose impairs cardiac E-C coupling in a glycosylation-dependent manner.Am J Physiol,1997,273 (12):H2876-2883.

[2]Frazier KS,Paredes A,Duber P, et al. Connective tissue growth factor express in the rat remnant kidney model and association with tubular epithelialcell undergoing transdifferentiation.Vet Pathol,2000,37:328-335.